DNA提取和常见问题

合集下载

DNA和RNA提取方法及原理

III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）
组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组dna时要选择有核细胞白细胞组培细胞培养时间不能过长否则会造成dna降解含病毒的液体材料dna含量较少提取前先富集基因组dna的提取质粒dna的提取使用处于对数期的新鲜菌体老化菌体导致开环质粒增加培养时应加入筛选压力否则菌体易污染质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒如为低拷贝或大质粒则应加大菌体用量菌株不要频繁转接质粒丢失细胞裂解细胞裂解材料应适量过多会影响裂解导致dna量少纯度低针对不同材料选择适当的裂解预处理方式
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量
菌株不要频繁转接（质粒丢失）

分子实验中核算DNA提取常见问题及分析

分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。

2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。

3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。

不同来源样品的加样量不同。

4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。

洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。

同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。

二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

DNA提取常见问题

DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。

它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。

用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。

而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

DNA测序技术的使用中常见问题

DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。

然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。

本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。

1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。

低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。

常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。

解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。

- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。

- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。

2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。

然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。

解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。

- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。

3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。

然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。

解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。

选择合适的方法来检测特定类型的突变。

- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。

- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。

4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。

如何克服基因工程技术在实验中的常见困难

如何克服基因工程技术在实验中的常见困难基因工程技术作为一种重要的生物技术手段，已经在医疗、农业和生物学研究等领域取得了显著的成就。

然而，在基因工程实验中常常面临各种困难与挑战。

本文将就常见困难进行深入探讨，并提供一些建议来克服这些困难。

一、难以获取所需DNA样本在进行基因工程实验时，获取所需的DNA或RNA样本是一个重要的第一步。

然而，由于某些物种的DNA提取困难或样本稀缺，科研人员常常面临这一挑战。

为了克服这个困难，可以尝试以下方法：1.1 合理设计实验方案：在实验设计时，要合理规划样本的来源，选择适当的物种和组织，并确保能够获取足够的DNA或RNA样本。

1.2 扩大样本采集范围：如果某种物种的样本难以获得，可以考虑从相关物种或亲缘物种中获取相似的基因序列以进行操作。

1.3 应用现代分子生物学技术：可以通过利用现代分子生物学技术的方法，例如PCR扩增、基因克隆等，扩增所需的DNA片段，以获得足够的样本。

二、选择适当的表达载体在基因工程实验中，合适的表达载体对于成功表达目标基因至关重要。

然而，在实验中常常会遇到表达效率低下、蛋白质积累不稳定等问题。

为了克服这些困难，可以采取以下措施：2.1 选择适当的宿主表达系统：根据实验需求和目标基因的特点，选择适当的宿主表达系统，如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等。

2.2 优化启动子和调控序列：启动子和调控序列对于基因的表达水平和稳定性起着重要作用。

通过合理设计启动子和调控序列，可以提高目标基因的表达水平和稳定性。

2.3 优化表达条件：调整培养基成分、温度、培养时间等条件，优化表达条件，以提高表达效率和蛋白质的稳定性。

三、克服基因编辑技术的难题基因编辑技术作为基因工程的一项重要技术手段，已经引起了广泛的关注。

然而，在实际应用中，常常会面临一些困扰和难题。

下面提供一些建议来克服这些问题：3.1 提高工具的特异性：为了避免非特异性的基因编辑，可以选择更加特异性的基因编辑工具，如CRISPR/Cas9技术中的高特异性锚型RNA。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结

结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱

DNA测序常见问题分析及解决办法总结

DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。

3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。

•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。

有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。

•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。

有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。

纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。

•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。

•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。

•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。

•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。

引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

DNA提取总结

(1)将小麦叶片（约0.1g）放入研钵中，加入液氮冷冻，快速研成粉末后倒入1.5mL离心管中；(2)每管加入600μL SDS DNA提取液（含2%的巯基乙醇），于65℃水浴30min，其间温和混匀几次；(3)取出离心管，加入60μL 5mol/L KAc，立即上下颠倒温柔混匀（5~6次），冰上放置20min；(4)于12,000 rpm离心10min；(5)将上清液（约600μL）转移至新的离心管中，加入4μL RNase，室温放置5min；(6)加入600μL酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）；(7)于12,000 rpm离心15min；(8)将上清液转移至新的离心管中，记下体积，加入0.6~0.7倍体积的异丙醇，于-20℃下沉淀10~30min；(9)于10,000 rpm离心5min，弃上清，将沉淀用75%乙醇洗2~3次；(10)挥发干净乙醇，加入50μL ddH2O，-20℃保存;(11)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。

学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

DNA和RNA提取原理及常见问题分析

硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经DEPC 处理的水溶解RNA
材料准备及裂解
RNA的提取
尽量使用新鲜材料，条件允许的情况下现取现提组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存（动物的脾脏及消化系统中RNA 非常容易降解，同时DNA的含量丰富，操作应格外的快速小心）。液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。
杂质的抽提
RNA的提取
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提
RNA的沉淀和溶解
RNA的提取
含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70％乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 样品收集后或需长期保存时应置于－70℃ 或加入RNase抑制剂，分装使用
提取RNA的注意事项
经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。使用有效的RAase抑制剂
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。原因
1.
1.

DNA提取及常见问题解决方案

二、基因组DNA-SDS法
（1）原理
SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55 -65℃）条件下能裂解细胞．细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。
提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。
策
烈，DNA被机械打断
4. 外源核酸酶污染
5. 反复冻融
1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融
2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液
3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量
4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
一、基因组DNA-CTAB法
（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexademide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液（ Nacl ＞0.7mol/L ）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
DNA提取原则
1、应保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染 3、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
一、标本的要求和保存
血液 EDTA做抗凝剂，不可用肝素
RNA DNA
尽快提取或者-20℃保存 4℃短期保存
组织
新鲜组织
液氮罐保存（-80℃）
石蜡玻片和包埋组织应没有H.E染色
室温保存
上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用

DNA提取和常见问题分析及对策

D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

植物和动物的核酸dna和rna提取方法

提取植物和动物的核酸DNA和RNA是生物学研究中的重要步骤，它们可以帮助科学家们更深入地了解生物的遗传信息和基因表达。

本文将介绍植物和动物核酸DNA和RNA的提取方法，让读者对这一过程有一个清晰的认识。

一、植物核酸DNA提取方法1. 细胞破碎：需要将植物组织破碎，以释放细胞内的DNA。

这可以通过磨粉或切碎的方法来实现。

2. 细胞裂解：接下来，使用裂解缓冲液来裂解细胞膜和细胞壁，释放DNA分子。

裂解缓冲液的配方可以根据不同植物的特性进行调整。

3. 蛋白质沉淀：通过向裂解液中加入溴化苯酚等物质，可以沉淀掉大部分蛋白质，使得DNA分子得以分离。

4. 乙醇沉淀：将裂解液中的DNA用乙醇沉淀，这样可以将DNA分子从溶液中提取出来。

5. 溶解和纯化：将沉淀的DNA分子溶解在适当的缓冲液中，并进行进一步的纯化和浓缩处理，得到纯净的DNA溶液。

二、植物核酸RNA提取方法1. 细胞破碎：与DNA提取类似，首先需要将植物组织破碎，以释放细胞内的RNA。

2. 细胞裂解：使用特制的裂解缓冲液来裂解细胞膜和细胞壁，释放RNA分子。

不同植物组织的RNA特性可能有所不同，需要根据具体情况进行优化。

3. 蛋白酶处理：加入蛋白酶来降解蛋白质，使RNA得以更好地纯化。

4. 酚-氯仿提取：利用酚-氯仿混合液可以有效地将RNA从裂解液中提取出来，与DNA提取类似。

5. 洗涤和纯化：对得到的RNA进行洗涤和纯化处理，得到纯净的RNA溶液。

三、动物核酸DNA提取方法1. 组织裂解：将动物组织进行细胞破碎，释放细胞内的DNA。

2. 细胞裂解：使用特制的裂解缓冲液来裂解细胞膜，释放DNA分子。

对于硬质组织，可能需要较强的裂解条件。

3. 蛋白酶处理：加入蛋白酶来降解蛋白质，使DNA得以更好地纯化。

4. 酚-氯仿提取：利用酚-氯仿混合液可以有效地将DNA从裂解液中提取出来，与植物DNA提取类似。

5. 溶解和纯化：对得到的DNA进行溶解和纯化处理，得到纯净的DNA溶液。

DNA测序常见问题及其分析

测序常见问题及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTUUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。

如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、poly A/T和C/G cluster导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

细菌基因组DNA的提取

2.
对策
3.
4. 5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理

核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。

核酸提取的一般过程 3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0

核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠

[专题]《DNA的粗提取和鉴定》实验中的几个常见问题

《DNA的粗提取和鉴定》实验中的两个常见问题陶晓东（江苏省常州市武进高级中学生物组213161）摘要：中学实验中提取DNA的实验材料的选择问题，几种实验材料各自的优缺点；DNA鉴定过程中易出现的一些常见问题及具体的解决方案。

关键词：鸡血细胞DNA提取液二苯胺试剂人教版高中生物教材第二册（必修）中的实验十一《DNA的粗提取和鉴定》是一个比较重要的学生实验。

该实验比较复杂，在实际操作过程中需要注意的细节问题也非常多，而且往往因为某个环节的操作不当，结果不能观察到明显的实验现象。

因此，有必要对实验过程中应当注意的问题做一些探讨。

从我个人和学生的实际实验操作过程中，我认为有以下两个问题值得注意。

一、实验材料的选择问题：虽然各种生物细胞中都含有大量的DNA，但是并不是每一种生物组织都适合做提取DNA的原材料。

比较好的实验材料最好应该满足以下几个条件1．组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。

2．该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某些干扰。

3．实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。

4．实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作。

可用于提取DNA的实验材料很多，人教版高中生物第二册教师教学用书中提供了两类可用于提取DNA的实验材料：鸡血和植物组织（新鲜菜花、蒜黄、菠菜等）；另外在《实验教学与仪器》杂志2002年第一期的《探讨“DNA 的粗提取与鉴定”的实验改进》一文中提供了另一种可行的实验材料：鱼类的精巢；此外，在高教出版社《生化实验方法和技术》一书中还介绍了一种从动物胸腺中提取DNA的方法，这是一种大学教材上提供的方法。

这几种实验材料由于各自性质的差异，实验的操作过程和步骤有很大的差别，以下是四种实验材料特点的粗略比较。

注：SDS：十二烷基磺酸钠EDTA：乙二胺四乙酸二钠根据以上对比可以看出,如果从取材方面来考虑的话,以动物胸腺组织作为实验材料是不经济的,而且还要面临中学实验条件的限制等问题。

DNA和RNA提取常见问题分析及对策

基因组DNA－ CTAB法基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制螯合Mg 离子，抑制DNase活性；活性；螯合活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；提供一个高盐环境， DNP充分溶解存在于液相中；充分溶解， CTAB溶解核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，巯基乙醇是抗氧化剂
质粒DNA－质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体上清液沉淀
溶液I充分重悬溶液充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解溶液裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液溶液质粒
溶液III中和溶液中和
离心洗涤
质粒DNA－质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； DNA在冷却时即恢复其天然构象价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。

基因组的dna提取与纯化中dna含量低的原因

基因组的dna提取与纯化中dna含量低的原因1. 引言基因组的DNA提取和纯化对于后续实验的进行非常重要，因为DNA 是产生生命的重要物质。

然而，有时DNA的提取和纯化过程中会出现DNA含量低的情况，这会用影响后续实验的结果。

本文将讨论在DNA提取和纯化中，DNA含量低的原因。

2. DNA提取的基本步骤DNA提取通常分为三个步骤：细胞破裂、DNA分离、DNA纯化。

其中，细胞破裂是最关键的步骤，因为它决定了DNA是否能够被有效地分离。

在细胞破裂时，常用的有生物法和物理法两种方法。

生物法是指使用化学试剂或酶，将细胞膜和核壳破裂，使DNA裸露。

物理法则是通过机械方法（如高压），来破裂细胞膜和核壳。

在细胞破裂后，可以通过离心来分离DNA。

DNA纯化是为了减少杂质对DNA产生影响。

纯化方法通常为盐溶、硅胶柱纯化、离心管纯化等。

这些方法可以将DNA从其他杂质中分离出来，获得较干净的DNA样品。

3. DNA含量低的原因DNA含量低通常有以下几个原因：3.1 样品来源不纯样品来源不纯可以是由于取样不规范导致，也可以是外源性DNA污染导致。

比如，从土壤中提取DNA时，土壤中的微生物DNA可能会干扰样品中目标DNA的提取和纯化。

因此，必须在取样和提取前进行预处理，以确保目标DNA可以被有效地提取。

此外，对于人类样品，样品处理要避免污染，如手套的使用，每次操作都更换器材等。

3.2 细胞破裂效果不理想细胞破裂是DNA提取的关键步骤之一。

如果细胞破裂效果不理想，将会导致DNA含量低。

在细胞破裂时，需要考虑一些因素，如细胞密度、细胞类型以及细胞破裂方法等。

如果细胞密度过高或者破裂方法不当，就有可能导致DNA破坏或者不完全释放，从而降低DNA的提取量和纯度。

3.3 质量差的DNA纯化纯化方法也是影响DNA含量的一个因素。

如果选用质量差的纯化方法，可能会导致DNA遭受损伤或者丢失。

同时，以前某些纯化方法对一些DNA形态脆弱的样本存在一定的损伤，如某些ungi、植物的叶片、种子等，在这些情况下，DNA含量会出现不同程度的降低。

全血基因组DNA提取(磁珠法)的常见问题汇总

全血基因组DNA提取（磁珠法）的常见问题汇总（一）文章来源：洛阳吉恩特生物科技有限公司随着磁珠法核酸提取技术的不断普及，越来越多的实验室会用到磁珠进行DNA提取，在使用的初期阶段，也会遇到各种各样的问题，近期就有许多老师和我们讨论如何利用磁珠进行全血基因组DNA的提取，我们对其中的常见问题进行了总结，供各位老师参考。

1、上样量与裂解体系上样量是DNA提取的经典问题，无论用什么方法，首先要解决的就是上样量问题，不同的上样量对应不同的试剂体系，上样量过多或多少都会影响裂解的效果。

以GNT-B02的磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒为例，标准上样量为200ul，上下浮动不超过100ul，搭配的裂解液用量为400ul，有些老师由于实验要求，需要大体积的上样量，这在实际操作中，就需要对磁珠法的操作流程进行改良，一般的改良思路是按比例放大裂解体系；但有些实验的上样量达到毫升以上，这种情况下，就不能再简单的放大裂解体系了，需要先用红细胞裂解液对样品进行处理，将上样体积浓缩后，再进行磁珠法操作流程的优化。

2、磁珠结团磁珠结团是经常遇到的现象，是由磁珠本身特性和磁珠所处试剂环境两方面造成的，有些磁珠不仅在全血DNA提取过程中会结团，其他的样本也同样会结团，有些老师在初次遇到这种现象的时候会感觉不适应，其实结团现象可以用来提前预判实验结果，结团往往是吸附了大量核酸，如果哪次实验没有结团，本次的实验结果或许会不太好，不过也不能一概而论，杂质太多也是引起磁珠结团的原因。

通过修改试剂配方，优化试剂配置，可以改善磁珠的结团现象，但是该工作较为复杂，需要对各种参数进行调整。

不过对于磁吸速度较慢的磁珠，结团后能明显提高磁吸速度，提高实验效率，只要磁珠在洗脱步骤能够分散，而且结果也在标准范围内，磁珠结团并不会影响整体效果。

3、得率低得率是影响下游实验的最直接因素，根据我们的经验，200ul的全血，得率一般在3ug以上，用GNT-B02的试剂盒，能稳定在5ug以上，有些老师的实验结果只有2ug左右，甚至更低，这就需要重点排查两个环节，一是裂解环节，二是洗脱环节，若是裂解环节的问题，往往会是在结合的时候磁珠不结团，或在洗涤的时候上清液颜色为深黄色或红色，这种情况下，更换全新的裂解液，并且严格按照SOP操作是较为效率的解决办法。

常见提取总DNA,RNA的方法与注意事项

提RNA可是电泳后什么条带都没有，用的是REDzol,是因为细胞太少了还是别的什么原因，在加了氯仿后没有出现 3 层，只有沉淀和上清,是不是因为加氯仿到离心隔的时间太久了参考见解：1、样品量太小；2、操作时没有严格按照提RNA勺要求做，一般需要带手套，最好带上口罩，所有塑料用品需要用DEPC处理并高压，要在超净台上操作，尽量不让外源的RNA酶降解RNA3、RNA电泳的电泳液和胶必须现配现用，并且要用DEPC处理，电泳槽、制胶板先用蒸馏水洗涤然后用75％的酒精处理,还有,要单独一个槽子跑, 不要和其他胶一起跑。

跑胶时间控制在10 分钟左右。

4、在加了氯仿后没有出现3 层,只有沉淀和上清, 可能是加的氯仿量不合适,一般是按氯仿/mlTrizol 加氯仿的。

从加氯仿到离心隔的时间对这个应该没有影响。

5、在提完RNA后可以测0D直，如果0D直在之间，说明提的RNA 比较纯。

RNA提取可不可以不用DEPC处理，多次灭菌（而不是长时间灭菌）也可以比较有效地灭活RNAse这种方法确实可行吗参考见解：DEPC主要目的是防止RNA酶,其实还有很多其他的方法处理器皿的，如氯仿冲洗，NaOH处理,高温烘烤等另外两次灭菌也可以代替DEPC处理.提RNA勺关键在于：防止内源性或外源性RNase降解RNA 对付外源性RNase有两种办法：能烤者烤，能泡者泡。

比起其他的核酸实验来说，就多这么一步。

其二、RNase分子内部存在二硫键，一般条件变性后很快即可复性，所以极为稳定；而且其作用条件“简单、快捷” ——与绝大多数DNase不同，不需要二价阳离子即可迅速发挥酶切作用。

所以，要想长期保存RNA标本，DEPC处理溶液、Tip头等都是必不可少的。

RNase一般高压不能灭活，如果不用DEPC勺话，快速提取，快速使用，不能贮藏。

3 个关于乙醇单词：ethanol ；alcohol ；mercaptoethanol ，他们的主要区别是什么，可以互相代替吗参考见解：ethanol 是乙醇的专业名词，是用在医学，工业等方面，主要是指工业酒精。