超分辨率成像揭示不同表观遗传学状态下的不同的染色质折叠方式

超分辨率成像揭示不同表观遗传学状态下的

不同染色质折叠方式

多细胞动物基因组在多个空间尺度下被组织起来，整个染色体通过把DNA 包装成单个核小体的方式来分隔在不同的领域。基因、基因簇和调节结构域的大小都在千碱基到兆碱基尺度范围内，而在该尺度范围内，DNA的三维组织形式与多基因的调控机制有关，但是对该组织形式的认识依然不是很清楚。在该尺度范围下，基因组被分隔成不同的表观遗传学状态下的结构域，而这些不同的表观遗传学状态对调节基因的表达来说必不可少。在这里，我们使用高分辨率成像来研究不同表观遗传状态下染色质3D组织形式。我们把果蝇细胞中的基因组结构域分为转录活化、转录失活和多梳抑制（Polycomb-repressed）三种状态，并观察每种状态下不同的染色质组织形式。这三种染色质类型都显示了其3D物理尺寸与结构域长度成幂次压缩，但是每一个类型拥有自己的压缩指数。多梳抑制结构域具有最高密度的包装形式和最有趣的染色质折叠行为，并且结构域的长度越长其染色质的组装密度越高。与彼此相似的转录活化、转录失活状态的组织形态不同，多梳抑制结构域以染色质具有高度的结构域混合为特点。此为，与失活结构域相比，多梳抑制结构域在空间上对同样邻近的活化结构域有更强的排异性。计算模型和基因敲除实验结果表明，在被抑制的染色质的这些特有的组装特性里，多梳蛋白家族介导的可逆的染色质交互作用扮演一个了重要的角色。总得来说，我们的高分辨率成像发现了在千碱基到兆碱基尺度范围下的不同表观遗传学状态中的不同的染色质组装形式，而千碱基到兆碱基长度的尺度大小直接与基因组调控相关。

多方面的证据表明，在千碱基到兆碱基尺度下的染色质空间组织形式对基因组功能很重要。基因、基因簇和调节结构域的大小都出现在这个尺度范围内；此外，通过这个距离范围隔离的基因组成分之间的物理性相互作用，比如启动子-增强子的相互作用，对基因活动来说是非常重要的。最近高通量的染色质构象俘获测量研究发现了，单个染色体被划分为长度从几十个千碱基到几个兆碱基不等的接触结构域或拓扑关联结构域，且这些结构组织形式可能与不同的基因组功能相联系。根据生物化学修饰和DNA结合蛋白的不同，染色质被划分为不同表观遗传学状态的结构域，。但是，染色质的3D空间组织形式在不同的表观遗传学

状态下是如何变得不同的，我们还知之甚少。

染色质在不同的表观遗传学状态下的空间组织形式的直接成像需要有在原位特异地标记基因组DNA并以高分辨率来给染色质结构成像的能力。在这里我们采用荧光原位杂交（FISH）技术，以添加荧光染料的互补寡核苷酸作探针来标记基因组的特定区域。我们采用修改过的Oligopaint方法来生产成千上万的独特寡核苷酸探针，并使用大规模并行处理的方法，用该探针去标记千碱基到兆碱基长度的基因组区域。用最近报道的酶促扩增的方法来实现了合成探针的高产出量（延伸数据图1和补充方法）。我们用固定的渗透平衡条件来使收缩作用最小化并观察没有明显收缩现象的染色质（延伸数据图2）。然后我们用超分辨率成像方法来给被标记了的染色质区域成像，即3维随机光学重建显微技术（3D-STORM）。该方法可以产生细胞中的特定基因组区域xy方向20nm和z方向50nm分辨率的成像。

我们给果蝇Kc167细胞系的46个由表观遗传学定义的基因组结构域成像。我们根据染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）和DNA腺嘌呤甲基转移酶识别（DamID）的数据（图1a）来确定的组蛋白修饰和调节蛋白的富集情况，把这些区域分为三种主要的表观遗传学状态------转录活化、转录失活和多梳抑制（下面分别称活化型、失活型和抑制型），像前面所描述和补充的方法一样。活化染色质结构域富集组蛋白H3K4位点2甲基化或者H3K79位点3甲基化。抑制型染色质结构域富集H3K27位点3甲基化或多梳蛋白家族（PcG）。失活型染色质结构域则主要以无修饰的组蛋白占优势，并且缺乏PcG蛋白和转录活性因子。在果蝇细胞中，这些结构域的长度包括了所有的被观察到的三种表观遗传学状态类型（大约10-500kb）。

相较于普通的荧光成像，这些结构域的STORM成像充分地揭示了更多的结构信息（图1b和延伸数据图4）。从这些超分辨率成像中，我们首次测量到了由每一个结构域所占有的物理体积，并把该体积作为该结构域DNA的密度的测量数据（图1c和延伸数据图3b、c）。这些体积的测量数据显示了细胞间的变化（延伸数据图5a、b），该变化可能反映了表达状态和细胞类型的差异。然而，每种结构域超过50个体积数据的平均值显示了3种表观遗传学状态的结构域类型的明显差异。在我们研究的整个近两个数量级长度的结构域中，活化型结构域的中

等体积总是比相同长度的失活型结构域要大，而失活型结构域的体积又总是比相同长度的抑制型结构域要大（图1c，实线圈）。这些结果和以前的数据所显示的结果是一致的，都说明了PcG蛋白可以压缩染色质和转录活化的染色质区域会倾向于比转录失活的区域更加开放的结果。

特别的，染色质结构域的物理体积(V)与长度（L）显示了一个幂次的压缩行为，即V ∝L b，并且其压缩指数b各不相同（图1c，实线圈；延伸数据图3b、c）。失活型染色质结构域的压缩指数为b = 1.00 ± 0.04（± 标准差），表明不同长度的染色质的三维密度是恒定的。活化型染色质结构域的压缩指数明显大于1（b = 1.26 ± 0.05),），表明染色质结构域越长其组装密度就越小。抑制型染色质结构域的压缩指数显著小于1（b = 0.76 ± 0.03），表明染色质结构域长度越长其组装密度也越高。作为染色质结构域物理尺寸的代替测量数据，我们决定把分子位置的均方根距离定义为回旋半径（R g），该均方根距离通过STORM测量每一个结构域中的这些位置的几何中心得到（补充方法）。当用R g来代替L，幂次压缩也能被观察到，即R g ∝L c，其中活化型、失活型和抑制型结构域的压缩指数c分别是0.37 ± 0.02，0.30 ± 0.02和0.22 ± 0.02（图1d，实线圈；延伸数据图3d）。在多个染色体的不同基因组区域中，这些压缩行为是守恒的（延伸数据图3a、b），表明不同的组装行为是表观遗传学状态的特点。表观遗传学状态也会影响通过染色体构象俘获测量的接触频率的压缩比例，但是接触频率是如何与尺寸测量数据相关的，这里还有待进一步了解。除了不同的尺寸比例性质，我还发现，这些不同类型的表观遗传学结构域也倾向于拥有不同的三维形状特点（延伸数据图3e、f）。

接下来，我们探索了在表观遗传结构域中，染色质的折叠方式。为了达到该目的，我们给每种表观遗传类型选择了两个大染色质结构域，并测量这些不同长度的结构域的内部区域的R g值，然后把它作为子结构域（图2a、b；延伸数据图5c；延伸数据表1）。有趣的是，失活型和活化型结构域都显示了一个各自相似的组织形式，而它们内部的子结构域展示了与整个表观遗传结构域相似的压缩行为（图2b，左边和中间）。而与之形成鲜明对比的，我们研究的抑制型结构域（双胸(图2b，右)）和触角基因（延伸数据图6）复合体）却没有被观察到自相似的组织形式。相反的，R g值随子结构域长度的一个函数迅速增长，以致于子结构域