Western_Blot详解及问题分析

确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压 太高。转膜过程注意降温
Western Blot
转移到膜上的蛋白很少 原 因 蛋白分子量< 10KD
蛋白的等电点< 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜 2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入 0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O

DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。

按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
Western Blot
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可 以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫
键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链 形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

Western Blot
Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？ 胶板洗刷干净


加入AP和TEMED的量要合适
加入试剂后摇匀，使其充分混合，防 止部分胶块聚合不均匀


温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐
Western Blot
不连续电泳：
作用
浓缩胶 分离胶 使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8TrisCl pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5% 高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
Western Blot
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%

蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
http://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性

2×SDS-PAGE上样缓冲液：
1M Tris-HCl(pH6.8) 1M DTT SDS 甘油 溴酚蓝 总体积 10 ml 20 ml 4g 20 ml 0.2 g 100ml

Western Blot
转移膜的选择

最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜， 此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白 印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于 核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍：

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
Western Blot
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
Western Blot
膜解吸方法（膜的重复利用）

通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。
http://www.bbioo.com/bio101/2008/21461_2.htm


Western Blot
湿转系统
Western Blot
半干转移系统
Western Blot
转膜后检测（此步可以省略）
丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。

有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，
包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
Western Blot
蛋白样品的定量

目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
Western Blot
SDS：

阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。

Western Blot
Western Blot
Western Blot 流程

蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒
（2）平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电 荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
灌制积层胶
插入梳子
Western Blot
Staking gel
Separating gel
Western Blot
转膜

要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，
简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网
状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明
度。是良好的电泳介质。
Western Blot
聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）；
• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑” 条带？
Western Blot
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
条带歪斜或漂移？
单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？

电转仪长期使用导致海绵变薄，“三
明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
（核黄素——TMTED）体系。
Western Blot
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％）
15
线性分离范围（KD)
12-43
10
7.5 5.0
16-68
36-94 57-212
SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：http://bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html
Western Blot
杂交信号很弱
原 因 抗体保存不当
抗原不充足 膜的漂洗过度
1.
1. 2. 3.
对 策
2.
3.
抗体长期保存应在－70℃ ，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知 标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数
Western Blot
出现非特异带
原因
1.
2.
一抗不是唯一特 异的 二抗出现非特异 结合
Western Blot
Western Blot 基本原理
Western Blot
Western Blot 优点

高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应
1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot
Western Blot应用

目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳

凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液

Western Blot
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)
Western Blot
封闭

为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜 发生非特异性结合，使非特异性背景提高， 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。

5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影
响抗体与抗原的结合。
Western Blot
一抗、二抗孵育

把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。
加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温 孵育1-2小时或4℃过夜。
• 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；
Biblioteka Baidu
• 产物：三维网状结构凝胶
• 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals) 的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来
完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化
蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
张绍进
Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot
Western Blot 简介：

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC
膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，
对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western Blot
Western Blot结果分析

目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正 误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对 含量。 Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）
http://bbs.bbioo.com/thread-44929-1-1.html
1.
1. 2. 3. 4.
对 策
Western Blot
背景太高
原 因 膜没有均匀浸湿
膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交 叉反应 抗体浓度过高
1.
1.
2.
3. 4.
2.
对 策
3.
5.
4.
转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度