分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活

参
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考
文
献
Mart inek K , K lyachko N L, Kabanov A V et al. Biochim. Biophys. A ct a, 1989, 981: 161. 李建武 , 萧能赓 , 余瑞元 等 生物化学实验原理和方法 . 北京 : 北京大学出版社 , 1994. Lowry R R, Tinsley I J. J. Am. Oil Chem. Soc. , 1976, 53: 470.
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书名 现代 高分子物理学 ( 上、 下) 21 世纪的分析化学 有机化合物结构鉴定与有机波谱学 ( 第二版 ) 手性合成 ∃ ∃ ∃ 不对称反应及其应用 Internet 上的化学化工资源 光化学基本原理与光子学材料科学 药物分析方法与应用 英汉化学化工词汇 ( 第四版 ) 流动注射分析法 微波化学 作( 译) 者 殷敬华、 莫志深 汪尔康等 宁永成 林国强 李晓霞等 樊美公 马广兹等 科学出版社 方肇伦 金钦汉 篇幅 千字 1441 519 745 553 458 619 1573 4472 344 480 定价 元 120 50 58 55 35 54 120 98 29 42 出版日期 2001 年 3 月 2001 年 3 月 2001 年 1 月 2001 年 5 月 2000 年 8 月 2001 年 2 月 2000 年 1 月 2001 年 6 月 1999 年 8 月 2001 年 2 月 发行号 O 1218 O 1150 O 1105 O 1188 TP 1401 O 1178 R 0437 O 1033 O 1072 O 1091
摘
要
通过对胶束酶学对传统脂肪酶酶活测定的 改进 , 建立了 适合于 油包水 微乳液体 系中脂 肪
酶酶活测定的 分光光度方法。与传统方法相比 , 本 法克服了 底物乳 化液难 配制、 不稳定 等缺点 , 无需 进 行在 pH 缓冲溶液体系中的酸碱滴 定 , 提高了酶活测定的准确性。 关键词 微乳液 分光光度技术 脂肪酶酶活测定 实验教学
Abstract
Based on micellar enzymology, a modified experiment on lipase assay is described in this report,
which is intended for these students who major or minor in experimental biochemistry. The present method has some merits over the conventional one in the medium and technique used. Key words Microemulsion, Spectrophotometric technique, Assay of lipase activity, Laboratory instruction
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实验
试剂 琥珀酸二辛酯磺酸钠 ( AOT , 纯度 > 99% , Sigma 公司 ) ; 异 辛烷 ( 含 大约 0 02% 的水 , 色谱纯 , Sigma 公司 ) ; 脂肪 酶 ( L 1754, Sigma 公 司 ) ; 三 油酸甘 油酯 ( Sigma 公司 ) ; 油酸、 吡啶、 苯、 醋 酸铜、 Na2HPO4 及 KH 2 PO4 均为分析纯。 1 2 实验步骤 配制 50mmol L AOT 的异辛烷溶液; pH= 7 2 的 66 7mmol L 的 Na2 HPO4 KH 2 PO4 缓冲溶液; 以磷
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结果与讨论
在检测条件下, 1min 内产生 1 mol 油酸所需的脂肪酶量定义为一个活性单位( u) 。对同一商品
脂肪酶 , 用本法测得的比活性为 26 0 # 0 8 u mg, 用传统方法 ( 于 100mL 碘量瓶中加入 5 0mL 磷酸 缓冲液 ( pH= 7 2) 和 5 0mL 25% 油酸三甘油酯( 聚乙烯醇为乳化剂) , 放入 30 ∀ 的恒温振荡水浴中 , 5min 后加 入 2 5mg 酶 粉, 保温 20min 后, 取出 碘量 瓶, 加 10mL 95% 乙 醇, 以酚 酞 作指 示剂 , 用 0 05mol L NaOH 滴至粉红色为止。 ) 测得的比活性为 8 9 # 0 1 u mg 。 由于微量的酶粉很难称准并重复, 故事先将酶粉配成酶液更易操作。室温条件下, 酶液可稳定 12h。微乳液中脂肪酶底物对酶有一定的稳定作用 , 因此三油酸甘油酯最好在酶液加入前加入。实 验发现, 形成微乳液的水来自酶液 , 而水含量对酶活又有较大影响, 因此, 酶液的体积应加得比较准 确些。实验中为降低 AOT 对后续萃取步骤的影响, 当苯的体积与取样体积之和控制在 5 0mL 时取 样体积不应超过 0 5mL。为此, 可以通过调整酶浓度使水解产生的脂肪酸量落在油酸工作曲线的 线性范围内。油酸工作曲线的绘制方法类似于上述实验步骤 , 只是样品为 4 5mL AOT 的异辛烷溶 液+ 0 5mL 三油酸甘油酯+ 45 L 磷酸缓冲液+ 一定体积的油酸标准品, 而空白为 4 5mL AOT 的异 辛烷溶液+ 0 5mL 三油酸甘油酯+ 45 L 磷酸缓冲液。在 2 5~ 15 L 油酸范围内 , 吸光度 A 与所加
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标准品油酸的体积成线性关 系。若密度 按 0 894 计 , 分子量按 282 5 计, 此范围 内油酸重 2 2~ 13 4mg, 相当于 7 9~ 47 5 mol 油酸。
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结语
本文建立了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度方法。微乳液体系的引入和分光 光度技术的采用克服了传统脂肪酶酶活测定中底物乳化液难配置、 不稳定等缺点, 避免了在 pH 缓 冲溶液体系中进行酸碱滴定这一常令学生困惑的问题。此外, 光分析技术的采用, 也大大提高了酶 活测定的准确性。
酸缓冲液为溶剂配制 0 1mg mL 的脂肪酶酶液; 5( W V) % 的 CuAc2 水溶液 ; 在 CuAc2 水溶液中滴加 吡啶配成 pH= 6. 0( 在 pH 计上调控) 的 CuAc2 吡啶水溶液。 取两只 50mL 带塞锥形瓶, 用刻度移液管分别加入 4 5mL 50mmol L AOT 的异辛烷溶液和 0 5mL 三油酸甘油酯, 然后用微量进样器移取 45 L 1 0mg mL 的酶液于一只瓶中 ( 作样品) , 另一只瓶中加 入 45 L 66 7mmol L 的磷酸缓冲液 ( 作空白 ) , 将两只锥形瓶放入 30 ∀ 的恒温振荡水浴中保温 ( 转速 为 150r min) 。20min 后 , 用微量进样器从锥形瓶中各移出 0 4mL 反应液于两支 10mL 具塞离心管 中, 然后用刻度移液管在每只离心管中再加入 4 6mL 苯和 1 0mL 5% 的 CuAc 2 吡啶溶液 , 快速涡流 混合, 终止酶促反应。手工振摇 2min 后, 放入离心机中离心 5min。各取上清液于 1cm 玻璃比色皿 中, 以空白为参比, 测加酶反应液样品在 715nm 处的吸光度 A 。根据吸光度 A 值 , 在油酸工作曲线 上用内插法计算出油酸含量, 再根据酶活定义算出酶活及比活。
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实验技术
分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活
黄锡荣
1
张文娟
1
宋少芳
1
李越中
2
曲音波
2 济南 250100)
( 1 山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室 ; 2 山东大学微生物技术国家重点实验室
微乳液是由水、 表面活性剂和非极性溶剂 ( 简称油 ) 在适当配比条件下自发形成的热力学稳定、 光学透明、 宏观均一的单分散体系。它既可以作为油溶性物质的溶剂 , 又可作为水溶性酶的分散介 质。微乳液可以分成水包油( O W) 型( 即油分散在水中 ) 和油包水型 ( W O) ( 即水分散在油中 , 低水 含量的微乳液也 叫反胶束 ) 。在油包水 型微乳液中 , 酶分子被包 裹在小水滴 ( 也 叫小水池 ( water [ 1] pool) ) 中 , 其物理图像可参见有关文献 。 脂肪酶催化水解甘油三酯反应是在油 水界面上进行的。其催化效率不但取决于活性( 浓度) , 还取决于反应体系界面积大小。为了获得高的催化效率, 其水不溶性底物如橄榄油、 三油酸甘油酯 等必须分散在水中, 即借助于表面活性剂形成底物的乳状液。过去 脂肪酶酶活测定 这一基础生 [2] 化实验一直是在橄榄油乳化液体系中进行的 。这一乳状液体系有一些缺点 , 如制备麻烦( 需用超 声波装置 ) , 且不稳定易分层。此外 , 由于超声条件的差异 , 常常造成乳液液滴大小不均, 实验重复 性不好。再者, 乳状液体系是不透明的 , 不适合于用光学手段对底物或产物进行测定。如将底物增 溶在油包水微乳液介质中则可避免上述缺点。除此外 , 由于微乳液中水滴的大小远小于乳化液中 的油滴, 因此, 微乳液体系的界面积要比乳化液大得多 , 这有利于界面激活脂肪酶发挥其催化作用。 更重要的一点是脂肪酶活性大小可以通过变更水与表面活性剂的物质的量之比 ( 这是微乳液的特 征参数, 与水滴大小有关 ) 来调控。 关于反胶束体系中各种酶的酶学性质研究, 在过去的 20 年里一直是胶体与界面化学家与分子 [1] 生物学家研究的热点 , 并形成了 胶束酶学 ( micellar enzymology) 这一前沿交叉学科 。该研究不仅 在生物合成与转化领域里有着巨大的应用前景, 而且对加深理解天然磷脂体系中酶蛋白的功能也
黄锡荣 男 , 37 岁 , 副教授 , 主要从事分析化学教学与胶束酶学研究工作。
高等学校重点实验室访问学者基金资助 2000 08 28 收稿 , 2000 12 30 修回
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有重要帮助。因此, 微乳液体系中脂肪酶酶活测定具有很大教学意义。 在给定时间内, 脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸的物质的量成正比。在基础生化 实验教材中 , 生成的脂肪酸含量几乎都是用酸碱滴定方法来定量的 。由于该体系中含有 pH 缓 冲液 , 这种定量分析方法常常令学生们困惑。此外 , 耗碱体积小及指示剂终点变色不明显也造成该 滴定方法不准确、 不灵敏。分光光度方法可以弥补酸碱滴定方法的不足。 [ 3] 用分光光度法来测定脂肪酸的含量已有文献报道 。它是基于脂肪酸与铜离子形成铜皂 , 经 苯萃取后进行比色测定( 铜皂在 715nm 附近有一宽的吸收峰) 。在此基础上经条件摸索优化 , 笔者 开发出了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度技术。
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与磷相邻基团的电负性增加时 , 31 P NMR 化学位移向低场位移 , 如 : 杂原子硫、 氧、 氮 , 与磷直接相连将 使磷谱向 低场 位移。环数目增加 , 31 P NMR 向低场位移。糖环上羟基的构型差异以及双 键的构型不同也会对31 P NMR 的化学位移 值有所影响。 The relationship of chemical shift and structures of phosphorous compounds in 31 P NMR, including the coordination number, the type of the atom attaching to phosphorus, cyclic ring number and type, functional group, was reviewed. When the coordination number increases from 2 to 6,