从琼脂糖凝胶中回收DNA
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实验三 从琼脂糖凝胶中 回收DNA片段
一、实验目的
1. 了解DNA片段回收的原理； 2. 掌握用多功能DNA纯化回收试剂盒 回收DNA的方法。
二、实验原理
本实验所用的回收试剂盒的原理是在溶胶 /结合液DB (DR-1 Buffer)存在的条件下， 使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片 段吸附于(Spin column)的滤膜上。
附II：H.Q.＆.Q .凝胶回收试剂盒II
H.Q.＆.Q .Gel Extraction Kit II
1. 0.7g（700mg）--700 µ (1mg=1µL) L 2. --700µL NJ缓冲液 3. --混合物：55-65 ゜C，7min(期间需振荡混 匀2-3min)(正常为浅黄色) 4. -- 700 µ L溶液转到Mu-Pu纯化柱，8,000g10,000g, 1 min --弃去流出液
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I： TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收DNA 的操作步骤
1. 使用TAE或TBE缓冲液制作琼脂糖 凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖 凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼 脂糖凝胶。应注意尽量切除不含目 的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶 体积，提高DNA回收率。 注: 切胶时不要将DNA长时间暴露 于紫外灯下，以防DNA损失。
5. 将以上溶液（如超过750 μl ，将分到2 个吸附柱AC ）加到吸附柱AC中， 12000rpm离心30-60秒，倒掉废液； 6. 加700μl WB(已加入无水乙醇：15ml WB+60ml 无水乙醇)，12000rpm， 1min，去除废液； （加500μl WB，12000rpm，1min， 弃掉废液；） 7. 吸附柱AC放回至空收集管中， 12000rpm，2 min，尽量去除漂洗液；
五、注意事项
切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下， 以防DNA损失。 胶块一定要充分融化,否则会严重影响 DNA的回收率。 混合振荡操作不要过于剧烈。 灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60゜C 使用时有利于提高洗脱效率。 DNA需长期保存时，建议使用Elution Buffer。 纯化的DNA用于序列分析时，最好使用灭 菌的双蒸水进行DNA的洗脱。
7. 加入DR-1 Buffer的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。 注：当分离小于400bp的DNA片段时， 应在此溶液中再加入终浓度为20%的 异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于 Collection Tube上。 9. 将步骤7的溶液转移至Spin Column中， 12,000rpm离心1分钟，弃滤液。 注：如将滤液再加入Spin Column中离 心一次，可以提高DNA回收率。
10.将500µ L的Rinse A加入Spin Column 中， 12,000rpm离心30秒，弃滤液。 11.将700µL的Rinse B加入Spin Column 中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。 12.重复步骤11。 13.将Spin Column安置于新的1.5mL的离 心管上，在Spin Column膜的中央处加 入25µ L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer， 室温静置1分钟。 注：把灭菌蒸馏 水或Elution Buffer加热至60゜C使用 时有利于提高洗脱效率。 14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
最后用Elution Buffer或灭菌的双蒸水溶 出DNA。
三、实验仪器、材料与试剂
仪器 1. 高速台式离心机 2. 微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管 3. 水浴锅，电子秤 材料 PCR实验切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶 试剂 多功能DNA纯化回收试剂盒所带；灭菌ddH2O， 无水乙醇
四、百泰克DNA回收试剂盒 回收DNA的操作步骤
1. UV下切下DNA条带，尽量切除不含 DNA的凝胶； 2. 将切下的胶块放入1.5ml EP 管中，称 重； 3. 加2倍体积的溶胶/结合液DB(如凝胶重 0.1g，加200μl DB溶胶液)； 4. 56℃水浴4-6 min 至胶完全溶解，每2 min涡旋震荡一次帮助加速溶解 ； （每100mg最初的凝胶重量加150ul的异 丙醇，震荡混匀）
5. -- 700 µL 乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液加 入柱中：静置2-3 min -- 10,000g, 1 min -弃去流出液（重复一次） 6. --空柱： 10,000g, 1 min （甩干！） 7. --柱子装入新的1.5mL EP 管中：30-50 µ L DNA洗脱缓冲液or无菌去离子水于柱基 质--静置1 min 8. -- 10,000g, 1 min 洗脱DNA.
3. 切碎胶块，可加快步骤6的胶块 融化时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。 以1mg=1µ L进行计算。
5. 向胶块（1%）中加入3个凝胶体 积量的胶块融化液DR-1 Buffer。 6. 混合均匀后75゜C加热融化胶块。 并间断振荡混合，使胶块充分融 化（约6-10分钟）。
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8. 取出吸附柱AC，至一新的EP管，在吸 附柱的AC膜中央加50 μl EB缓冲液（或 灭菌的双蒸水，EB最好现在65－70 ℃ 水浴加热，效果更好）。室温放置2 min；12000rpm，1min。 9. 如需要较多量DNA，可将步骤10得到 的溶液重新加入吸附柱AC中， 12000rpm，1min。
一、实验目的
1. 了解DNA片段回收的原理； 2. 掌握用多功能DNA纯化回收试剂盒 回收DNA的方法。
二、实验原理
本实验所用的回收试剂盒的原理是在溶胶 /结合液DB (DR-1 Buffer)存在的条件下， 使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片 段吸附于(Spin column)的滤膜上。
附II：H.Q.＆.Q .凝胶回收试剂盒II
H.Q.＆.Q .Gel Extraction Kit II
1. 0.7g（700mg）--700 µ (1mg=1µL) L 2. --700µL NJ缓冲液 3. --混合物：55-65 ゜C，7min(期间需振荡混 匀2-3min)(正常为浅黄色) 4. -- 700 µ L溶液转到Mu-Pu纯化柱，8,000g10,000g, 1 min --弃去流出液
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I： TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收DNA 的操作步骤
1. 使用TAE或TBE缓冲液制作琼脂糖 凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖 凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼 脂糖凝胶。应注意尽量切除不含目 的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶 体积，提高DNA回收率。 注: 切胶时不要将DNA长时间暴露 于紫外灯下，以防DNA损失。
5. 将以上溶液（如超过750 μl ，将分到2 个吸附柱AC ）加到吸附柱AC中， 12000rpm离心30-60秒，倒掉废液； 6. 加700μl WB(已加入无水乙醇：15ml WB+60ml 无水乙醇)，12000rpm， 1min，去除废液； （加500μl WB，12000rpm，1min， 弃掉废液；） 7. 吸附柱AC放回至空收集管中， 12000rpm，2 min，尽量去除漂洗液；
五、注意事项
切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下， 以防DNA损失。 胶块一定要充分融化,否则会严重影响 DNA的回收率。 混合振荡操作不要过于剧烈。 灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60゜C 使用时有利于提高洗脱效率。 DNA需长期保存时，建议使用Elution Buffer。 纯化的DNA用于序列分析时，最好使用灭 菌的双蒸水进行DNA的洗脱。
7. 加入DR-1 Buffer的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。 注：当分离小于400bp的DNA片段时， 应在此溶液中再加入终浓度为20%的 异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于 Collection Tube上。 9. 将步骤7的溶液转移至Spin Column中， 12,000rpm离心1分钟，弃滤液。 注：如将滤液再加入Spin Column中离 心一次，可以提高DNA回收率。
10.将500µ L的Rinse A加入Spin Column 中， 12,000rpm离心30秒，弃滤液。 11.将700µL的Rinse B加入Spin Column 中，12,000rpm离心30秒，弃滤液。 12.重复步骤11。 13.将Spin Column安置于新的1.5mL的离 心管上，在Spin Column膜的中央处加 入25µ L的灭菌蒸馏水或Elution Buffer， 室温静置1分钟。 注：把灭菌蒸馏 水或Elution Buffer加热至60゜C使用 时有利于提高洗脱效率。 14.12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
最后用Elution Buffer或灭菌的双蒸水溶 出DNA。
三、实验仪器、材料与试剂
仪器 1. 高速台式离心机 2. 微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管 3. 水浴锅，电子秤 材料 PCR实验切下的含有回收片段的琼脂糖凝胶 试剂 多功能DNA纯化回收试剂盒所带；灭菌ddH2O， 无水乙醇
四、百泰克DNA回收试剂盒 回收DNA的操作步骤
1. UV下切下DNA条带，尽量切除不含 DNA的凝胶； 2. 将切下的胶块放入1.5ml EP 管中，称 重； 3. 加2倍体积的溶胶/结合液DB(如凝胶重 0.1g，加200μl DB溶胶液)； 4. 56℃水浴4-6 min 至胶完全溶解，每2 min涡旋震荡一次帮助加速溶解 ； （每100mg最初的凝胶重量加150ul的异 丙醇，震荡混匀）
5. -- 700 µL 乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液加 入柱中：静置2-3 min -- 10,000g, 1 min -弃去流出液（重复一次） 6. --空柱： 10,000g, 1 min （甩干！） 7. --柱子装入新的1.5mL EP 管中：30-50 µ L DNA洗脱缓冲液or无菌去离子水于柱基 质--静置1 min 8. -- 10,000g, 1 min 洗脱DNA.
3. 切碎胶块，可加快步骤6的胶块 融化时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。 以1mg=1µ L进行计算。
5. 向胶块（1%）中加入3个凝胶体 积量的胶块融化液DR-1 Buffer。 6. 混合均匀后75゜C加热融化胶块。 并间断振荡混合，使胶块充分融 化（约6-10分钟）。
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8. 取出吸附柱AC，至一新的EP管，在吸 附柱的AC膜中央加50 μl EB缓冲液（或 灭菌的双蒸水，EB最好现在65－70 ℃ 水浴加热，效果更好）。室温放置2 min；12000rpm，1min。 9. 如需要较多量DNA，可将步骤10得到 的溶液重新加入吸附柱AC中， 12000rpm，1min。