金黄色葡萄球菌的测定

金黄色葡萄球菌的测定

1 卫生学意义

金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。

2 检验方法

2.1 术语与定义

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。

2.2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.3 培养基和试剂

（1）7.5%氯化钠肉汤

1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；

2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

（2）B－P琼脂平板

1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2

2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。

3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每

瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。

（3）脑心浸出液肉汤(BHI)

1）成分：胰蛋白质胨：10.0g；氯化钠：5.0g；磷酸氢二钠（K

2HPO

4

）：2.5g；

葡萄糖：2.0g；牛心浸出液：500mL；pH：7.4±0.2；

2）制法：加热溶解，调节pH，分装16 mm×160 mm 试管，每管5mL置121℃，15min灭菌。

（4）磷酸盐缓冲液

1）成分：磷酸二氢钾（KH

2PO

4

）：34.0g；蒸馏水：500mL；pH：7.2；

2）制法：

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的

1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。

（5）革兰氏染色液

①结晶紫染色液

1）成分：结晶紫：1.0g；95％乙醇：20.0mL；1％草酸铵水溶液：80.0mL；

2）制法：将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

②革兰氏碘液

1）成分：碘：1.0g；碘化钾：2.0g；蒸馏水：300mL；

2）制法：将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

③沙黄复染液

1）成分：沙黄：0.25g；95％乙醇：10.0mL；蒸馏水：90.0mL

2）制法：将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

④染色法

1) 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。

2) 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

3）滴加95％乙醇脱色15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

4) 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。

（6）无菌生理盐水

1）成分：氯化钠：8.5g；蒸馏水：1000mL；

2）制法：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

2.4 检验程序

2.5 操作步骤

（1）样品的处理

称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min 均质1min～2 min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。

（2）增菌和分离培养

1）将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

2）将上述培养物，分别划线接种到B-P平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18 h～24 h。B-P平板36℃±1℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。

3）金黄色葡萄球菌在B-P平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。

长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

（3）鉴定

1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。

2）血浆凝固酶试验：挑取、B-P平板或血平板上可疑菌落1个或1以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18h～24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL～0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，36℃±1℃培养18h～48h，重复试验。

（4）葡萄球菌肠毒素的检验

可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。

2.6 结果与报告

（1）结果判定：符合上述增菌和分离培养中的3）、（3）鉴定，可判定为金黄色葡萄球菌。

（2）结果报告：在25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。