植物烟草实验

烟草叶片愈伤组织诱导

摘要用不同成分培养基，附加0.8%琼脂，3%蔗糖，调pH5.8—6.0，取烟草叶片

作为外植体进行愈伤组织诱导培养，计算污染率、诱导率以及诱导情况，观察愈伤

组织的发生情况。实验表明，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。当细胞分

裂素高于生长素的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素低于生长素的浓度时，有

利于分化出根；当细胞分裂素及生长素的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长

旺盛。

关键词：烟草叶片愈伤组织诱导

前言

烟草（Nicotiana tabacum）又名草烟，属茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种，原产于美洲和大洋洲[1]。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料[2]。有报道烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质，因此很有必要对烟草的组培快繁进行研究，以获得更有效的方法提高产率和产量。柯善强综述植物细胞的遗传全能性与组织培养形态发生控制[3]，戴冕进行了烟草叶肉原生质体再生植株的研究[4] ,徐瑞娟等通过烟草花序苞叶的离体培养分化出花芽[5],战淑敏用烟草叶组织培养直接获得再生植株[6]。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织，观察愈伤组织诱导情况。

1.材料与方法

1.1 配置培养基母液，每2人为一个小组，配置以下培养基，并分装，灭菌，然后室温下放置一周。

1.2 取烟草叶片取烟草的嫩叶片作外植体。先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次后，置于超净台上，于无菌条件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于无菌瓶中用10%次氯酸钠溶

液浸泡20分钟至30分钟，再用无菌水冲洗4次，最后在无菌培养皿中将嫩叶片切成1cm见方小块，接种在培养基中。

1.3.1 观察污染情况：观察是否有细菌性污染（菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现）和真菌性污染（出现不同颜色霉菌,接种后3-10天出现），并计数。计算污染率。

污染率(%)=污染的材料数/总接种材料数×100%[7]

1.3.2 观察各培养基中的外植体产生愈伤组织的情况，愈伤组织出现时间和愈伤组织形态特征（颜色和质地等），计数形成愈伤组织的材料数，并计算诱导率。

诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%[7]

2.结果及分析

2.1愈伤组织诱导情况

三天后发现部分组有细菌性污染（如图1），7天后发现部分有真菌性污染。计算出污染率和如表1所示：

表1. 愈伤组织诱导的污染情况

造成污染的可能原因有：叶片消毒灭菌不彻底，接种室超净工作台消毒不彻底，接种操作时操作不规范等等。

叶片在第4天后边缘慢慢上卷，外植体开始膨胀，于接种后第7 天膨大成圆拱型，愈伤首先发生在叶片边缘, 为黄绿色颗粒状，有些呈现半透明。随着进一步培养, 10天愈伤组织不断加大。

排除褐变及感染的外植体后，诱导情况如表2所示：

表2.愈伤组织诱导情况

MS+NAA0.5培养基MS+6-BA2.0+2,4-D0.5培养基

1/2MS+NAA0.5+0.2%AC培养基MS+6-BA2.0+NAA0.2培养基

MS+6-BA1.0+2,4- D0.5培养基MS+6-BA1.0+NAA0.5培养基外植体从切口边缘开始膨胀。有研究表明，外植体边缘开始膨胀时，叶肉细胞已经明显增大，在切口附近的叶肉细胞，一些靠近小的维管束的栅栏组织细胞以及这些维管组织的薄壁细胞开始细胞分裂；当形成少量的愈伤组织时，由于激素的诱导作用，在切口处已形成一团活跃分裂的细胞，细胞体积明显减小，这种细胞分裂活动这时已扩展到其它部分的叶肉组织；在叶组织中形成了大量的分散的分生细胞团，细胞体积进一步减小，在这些活跃分裂的部位通常已无法辨认原来的叶肉细胞[8]。

在本组的培养基中愈伤组织生长旺盛，未见分化，原因是本组的培养基中，细胞分裂素6-BA及生长素NAA的浓度合适，比较有利于愈伤组织的诱导，而不太利于根和芽的分化[6]。而在他组的高细胞分裂素，低生长素的培养基中，添加了活性炭，有根的分化。原因可能是活性炭能吸附有害物质，减少负面影响，而且会使培养基变黑，创造暗环境，故相比其它培养基更有利于植物生根[9]。

3.讨论

不同的培养基会造成外植体不同的生长情况，其中，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。而不同的生长调节剂对于外植体的愈伤组织诱导及分化有着重要的影响，当细胞分裂素6-BA高于生长素NAA的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素6-BA低于生长素NAA的浓度时，有利于分化出根；当细胞分裂素6-BA及生长素NAA的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长旺盛。

在组织培养中，形成的愈伤组织有疏松型和致密型两种，疏松型的愈伤组织易于分化，将其进行继代培养效果更好。在李大卫等对大丽花的研究中[10]也说明了这个问题。再分化培养时，愈伤组织的初始状态不同, 再分化的能力相差很大,疏松型愈伤组织是外植体在脱分化过程中, 最早、最快分化出来的愈伤组织块；而致密型愈伤组织, 则是在脱分化过程中, 生长较慢的组织块, 以后又继续用脱分化培养基, 连续培养出来的。所以，再分化培养时，应选取疏松型愈伤组织, 以利于大量出苗。

而继代培养在初转接时，继代增殖倍数较低,增殖率也较低；随着继代次数的增加,其增殖倍数逐渐提高。原因是在嫩芽中逐步积累了较多的细胞分裂素,并逐渐适应了培养条件,通常将这一过程叫做驯化阶段；植物组织对细胞分裂素和生长素的要求也会有所降低；当继代增殖培养到达一定代数后,增殖倍数到达最高点,随后慢慢下降,同时,芽苗逐渐变得肥大、结构疏松、颜色变白或逐渐变得圆短[11]。因此用诱导出的大块愈伤组织虽然可以获得大量的小植株，但是继代培养多代后，效率就会明显降低。

参考文献

[1] 周仕顺, 掏志章. 烟草的组织培养[J]. 云南农业科技, 2005,(01)：22

[2] 施和平, 黄群声. 烟草叶片组织培养及植株再生(简报)[J].亚热带植物科学, 2003,(04):63