小麦组织培养研究进展

河南农业科学
1 .7 胚轴与胚芽鞘 刘选明等报道［33 ］，利用小麦胚轴及胚芽鞘为外
植体建立了体细胞无性系，并获得了可用于突变体
诱导与筛选的胚性愈伤组织细胞，而且得出结论，胚
轴的愈伤组织诱导率高于胚芽鞘，且胚轴愈伤组织
生长状态也优于胚芽鞘，但目前关于胚轴及胚芽鞘
作外植体诱导愈伤的报道很少，需进一步研究。
Research Advances of Wheat Tissue Cult ure
LI na ，JI AO Zhen ，GU Yun- hong ，@I n Guang- yong
（Provi ncial key Laboratory of Ion Bea m Bi oengi neeri ng ，Zhengzhou Uni versit y ，Zhengzhou 450052 ，Chi na ）
胚轴和胚芽鞘：种子经0 .1 % HgCl 2 消毒后接 种在 N6 、MS 的 无 激 素 培 养 基 上，在（25 3 ）C ， 1 200 l x 的光照条件下培养，待种子萌发至1 !2 c m 时，切取胚轴、胚芽鞘用于愈伤组织的诱导。
2 .2 培养基 因供试小麦品种不同，不同实验的侧重点不同，
幼叶：先将种子用70 % 乙醇浸泡1 !2 mi n ，无 菌水冲洗2 次，再用0 .1 % HgCl 2 灭菌10 !12 mi n ， 无菌水冲洗4 !5 次，然后接种到培养基上，在25 C 条件下培养，每日光照12 h ，待幼苗长至 5 !8 c m 时，从基部向顶部将叶片横切成2 mm 左右的小段， 按顺序接种。
目前研究表明，很多禾谷类植物的叶片在离体 条件下培养能够诱导出愈伤组织，如燕麦［14 ，15 ］、黑 麦［16 ，17 ］、大麦［18 ］等。但再诱导出苗比较困难，即使 有少量苗出现，也缺乏规律性，以小麦为实验材料的 研究也证明了这一点。但郝建国等报道，以小麦幼 苗叶基切段作起始材料，成功建立了愈伤组织形成 和植株再生的实验体系。鉴于小麦幼苗极易用成熟 种子发芽获得，又不受生长季节的限制，因此，用小 麦幼叶作外植体诱导出具有再生能力的愈伤组织， 进而进行外源基因导入等其他离体遗传操作，在不 易获得未成熟胚的季节和实验条件下，也不失为一
Abstract ：Wheat tissue cult ure is t he f oundati on and assurance of i mprovi ng Wheat Cualit y by plant gene engi neeri ng . I n t he diff erent tissue cult ure syste ms ，diff erent Wheat explants ，such as i mmat ure e mbryo ，i nflorescence ，mat ure e mbryo ，young leaf ，root ，seed ，ant her ，pl u malar axis and e mbryonic bud sheat h ，Were cult ured t o obtai n regenerati ve plants ，t he research advances of Which Were su mma-
收稿日期：2004 -12 -28 基金项目：国家“十五”科技攻关项目（2001BA302B -03 ） 作者简介：李 娜（1981 - ），女，河南开封人，硕士研究生，研究方向：小麦遗传育种。
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2005 年第8 期
形态指标：在幼种子发育到嫩绿色，脊部由光亮转变 为无光泽并具一层绒毛时，幼胚刚好发育到透明的 后期和半透明期，该时期仅有几小时，此时取材的幼 胚培养效果最好。这一形态指标的发现为取材节省 了大量时间，并大大减缓了接种压力［10 ］。
相比较而言，幼穗虽然比幼胚愈伤组织出现晚， 生长慢，植株再生绿苗率低，但在众多外植体中，幼 穗也不失为一种具有较高再生率的好材料。但不足 之处是幼胚和幼穗作为外植体源受到季节的限制， 在小麦生育期中适合取材的时间很短，且很难保证 其生育期的一致性，另外，材料的播种亦受季节的限 制［5 ，11 ］。为了找到既适合于培养又易获得的 外 植 体，人们进行了大量研究，发现小麦成熟胚可以有效 克服幼胚与幼穗的上述不足。 1 .2 成熟胚
根：小麦种子经70ห้องสมุดไป่ตู้% 乙醇浸泡30 s ，5 % 次氯酸 钠灭菌20 mi n ，无菌水冲洗3 次，接种于 MS 培养 基，暗处20 C 发芽，1 周后切除芽，将剩下的胚乳部 分和根一起接种。
种子和花药：小麦成熟种子和孕穗期的花药消
毒方法同成熟胚，然后直接接种于培养基上。接种
种子时注意种子的腹沟朝上。
幼穗：剥 出 幼 穗 外 层 叶 鞘，截 取 最 后 一 节 6 ! 7 c m，端口封Parafil m，0 .1 % HgCl 2 消毒4 !7 mi n ， 无菌水洗3 !5 次，在无菌条件下将幼穗剥离出，切 成1 !2 mm 的穗段，接种。
成熟胚：小麦成熟种子经70 % 乙醇浸泡5 mi n ， 无菌水冲洗 5 次，浸种 12h ；70 % 乙醇浸泡 1 mi n ， 0 .1 % HgCl 2 浸泡20 mi n ，无菌水冲洗4 !5 次后在 无菌条件下剥取胚，盾片向下接种。
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种可选用的方法［19 ，20 ］。 1 .4 根
迄今，由根形成的愈伤组织再分化出植株的报 道很少见。Tri one 等最早报道，小麦根愈伤组织诱 导成 功［21 ］。此 后，Shi mada 、Dudits 、Chi n &Scott 等 相继报道 以 小 麦 根 为 材 料 诱 导 出 愈 伤 组 织 和 不 定 根，但均没有获得再生 植 株［22 !24 ］。Bhoj wani 等 曾 从根愈伤组织获得极少再生植株，但重复实验没有 分化出再生植株［25 ］。蔡润等报道，用小麦根作外植 体诱导愈伤组织并成功获得再生植株，填补了国内 外小麦离体根培养再生植株研究的空白。由于小麦 种子根生长快速，是最容易获得的外植体之一，所以 利用离体根培养获得大量再生植株，有望为小麦育 种提供广泛的遗传变异［26 ］。
并且采用不同的外植体，故培养基的配方也就千差 万别。但采用的基本培养基一般为 MS 培养基，只 是添加的激素和营养成分的种类和浓度有所差别。 而且愈伤组织诱导培养基、继代培养基、分化培养基 与生根培养基的成分也各有差别。大量的实验都在 探讨最佳的培养基配方，在此不一一赘述。 2 .3 培养条件
实践证明，用小麦成熟胚作为外植体，可以保证 不同的个体间生理状况相似，而且取材方便，不受季 节限制，代价小，可大量获得。因此，已得到广泛的 研究应用［12 ］。但其愈伤组织的形成及植株再生能 力远远不 及 幼 胚 和 幼 穗，而 且 还 存 在 有 不 少 弊 端。 如伍碧华等报道，用成熟胚作外植体易被感染，感染 率高达 50 % 以 上，且 愈 伤 组 织 质 量 差，呈 水 浸 状。 于晓红等报道，用小麦成熟胚进行组织培养，愈伤组 织形成绿芽的频率较高。而唐宗祥等报道，实验中 采取切去果毛、2 次消毒的办法可以基本杜绝受感 染的现象。另外，采用切去胚芽和调整激素的办法 能够有效抑制愈伤组织的发芽。实验初步证明了用 成熟胚作为外植体进行组织培养进而获得转基因小 麦的可行性［13 ］。以上研究表明，利用小麦成熟胚诱 导、分化再生植株的方法还有待继续探索，以期为小 麦育种寻求较好的转基因受体并建立成熟胚的小麦 再生体系，进而为小麦新品种的选育奠定基础。 1 .3 幼叶
1 外植体来源
目前研究报道的小麦外植体源有幼胚、幼穗、成 熟胚、幼叶、根、种子、花药、胚轴和胚芽鞘等。张根 发曾经提出，脱分化能力与再分化过程具有一致性， 认为外植体的类型对小麦体细胞组织再生能力影响 很大。 1 .1 幼胚与幼穗
幼胚是目前公认最好的小麦外植体源，其愈伤 组织的诱导和植株再生能力最高。但小麦幼胚的培 养再生过程往往表现出明显的基因型差异，不同的 小麦基因型可以在致密愈伤组织的诱导、分化及分 化能力的保持等方面表现出较大差异［6 !9 ］。此外， 选择适宜的幼胚取材时期对获得相对较好的培养效 果是十分重要的。有文献报道，通过对30 个品种 （系）的研究，确立了小麦幼胚最佳取材时期的种子
有研究表明，小麦花药愈伤组织的再生能力很 强，经基因枪轰击后比较容易获得转基因植株，因而 也是小麦转基因的良好受体［29 ］。但花药培养在基 因型间的差异非常明显［30 ，31 ］，故筛选出适合花药培 养的优良基因型的研究还有待进一步深入。韩玉琴 曾报道［32 ］，小麦花药愈伤组织产生的时期对其分化 的影响很大。前期产生的愈伤组织分化率较高，随 着花药培养时间的延长，其愈伤组织的分化能力逐 渐减弱，而白苗率却相对较高。这可能与花药在含 2 ，4 - D 的培养基上时间过长有关，其作用机理还有 待进一步探讨。
rized i n t his paper . Key words ：Wheat ；Tissue cult ure ；Explant ；Plant regenerati on
小麦是世界上种植面积和产量均居榜首的重要 粮食 作 物。综 合 世 界 粮 农 组 织（FAO ）的 统 计 报 告［1 ］，1999 年，世界小麦种植面积达 2 .14 亿 h m2 ， 1997 !1999 年世界平均总产量为5 .88 亿t 。而且 小麦蛋白质含量可达其干重的10 % ，是人类蛋白质 的主要摄入来源。实践证明，利用植物基因工程改 良小麦品质是一行之有效的途径［2 ，3 ］。虽然转化方 法较多且日趋成熟，但限制其发展的一个重要因素 是小麦的植株再生频率低，而且建立稳定的小麦再 生体系也比较困难。所以，在小麦组织培养过程中， 建立高频率的植株再生体系是小麦转化成功的重要 基础和保证，而研究小麦组织培养条件和植株再生 频率的影响因素则是小麦生物技术育种中一个亟待 解决的课题［4 ，5 ］。笔者就不同来源和不同生理状态 的小麦外植体通过不同组培体系而最终获得再生植 株的进展作一简要概述。
1 .5 种子 以成熟种子作为组织培养材料，从其体细胞直
接诱导产生胚性愈伤组织的研究较少。从目前研究 现状来看，如果从种子体细胞直接产生愈伤组织，不 受时间和季节的限制，是最快速和简便的方法，已在 水稻研究中得到了广泛的应用，而在小麦上还存在 诱导率偏低的问题。有文献报道［27 ］，用小麦整粒种 子作为外植体，诱导率极低，其愈伤组织是由胚轴细 胞形 成 的，呈 透 明 状，生 长 缓 慢。 而 程 在 全 等 报 道［28 ］，通过对影响小麦种子体细胞产生愈伤组织的 几个主要因素的效应进行分析，已初步探讨出提高 小麦种子体细胞产生胚性愈伤组织的有效途径。结 果表明，用 小 麦 种 子 体 细 胞 产 生 愈 伤 组 织，种 子 经 4 C1 个月低温处理，用 MSP 培养基，种子腹沟朝 上接种，每天10 !14 h 白炽光照，多数小麦材料的 愈伤诱导率可显著提高，而且产生的愈伤组织大多 是胚性愈伤组织，易再分化产生植株。 1 .6 花药
河南农业科学
小麦组织培养研究进展
李 娜，焦 浈，谷运红，秦广雍
（郑州大学离子束生物工程省重点实验室，河南 郑州 450052 ）
摘要：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证。对 不同小麦外植体（幼胚、幼穗、成熟胚、幼叶、根、种子、花药、胚轴和胚芽鞘等）通过不同组培体系最 终获得再生植株的研究进展进行了综述。 关键词：小麦；组织培养；外植体；植株再生 中图分类号：$512 文献标识码：A 文章编号：1004 -3268（2005 ）08 -0011 -05
! 组培体系的建立
2 .1 材料处理 据文献报道，组织培养中不同小麦外植体的处
理方法不尽相同。下面简要介绍一下在实验基础上
总结出的较好的材料处理方法。
幼胚：取开花后14 !20 d 的小麦幼穗，剥出种 子，70 % 乙 醇 消 毒 1 mi n ，无 菌 水 洗 涤 1 次，再 用 0 .1 % HgCl 2 消毒5 mi n ，无菌水洗3 !5 次，无菌条 件下用镊子和解剖针将幼胚取出，盾片向下接种。