脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范详解知识

附件7 脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范

一、脑膜炎奈瑟菌鉴定程序和标准

1、 脑膜炎奈瑟菌细菌鉴定程序

脑膜炎奈瑟菌的鉴定通常是通过在CAP 和BAP 上生长物通过革兰染色镜检和生化反应检测以确定是否为脑膜炎奈瑟菌，在此基础上再通过脑膜炎奈瑟菌分群诊断血清进行血清分群。

图xx 脑膜炎奈瑟菌鉴定程序

2、 脑膜炎奈瑟菌感染确诊实验室检测

疑似流脑病例具有以下实验室检测结果之一，即可确诊：

1. 培养：自脑脊液或血液标本中分离到脑膜炎奈瑟菌。

2. 乳胶凝集检测：采用乳胶凝集检测试剂盒，脑脊液标本乳胶凝集检测结果BAP,CAP 生长物

革兰氏染色为阴性双球菌

氧化酶反应

阳性，进行生化鉴定 阴性，非脑膜炎奈瑟

生化鉴定（糖氧化）

Glu Mal Lac Suc

＋ ＋ － －

阳性，为脑膜炎奈瑟菌

进行血清分群 阴性，非脑膜炎奈瑟菌

A 、

B 、

C 、H 、I 、K 、L 、W135、

X 、Y 、Z 、Z ´(29E)不同血

清群

阳性，目前Bio-Rad乳胶凝集检测试剂盒能检测A群、B群、C群和W135/Y群脑膜炎奈瑟菌感染。

3.PCR检测：脑脊液标本或血液标本PCR扩增特异性脑膜炎奈瑟菌DNA 片段阳性。通过ctrA基因扩增，鉴定脑膜炎奈瑟菌，通过扩增orf-2、sia D(B)、sia D(C)、sia D(Y)、sia D（W135）等基因片段鉴别不同的血清群，或通过Real-time PCR检测出特异性基因片段阳性。

4.血清IgG抗体滴度4倍增高：恢复期血清抗体滴度较急性期4倍增高。

二、脑膜炎奈瑟菌标本接种培养

（一）脑脊液标本

1．脑脊液标本预处理

脑脊液标本送到实验室后，应立即离心，2000rpm，20min，用巴斯德吸管吸取上清，进行乳胶凝集实验检测抗原。离心后的沉淀进行剧烈振荡或充分混合。取1滴沉淀准备革兰染色，1滴划线接种原始培养基。（注意:如果获得的脑脊液不足1mL则不进行离心，直接用其进行革兰染色和涂板培养）。

2. 脑脊液标本初代培养脑膜炎奈瑟菌的初代接种培养基为巧克力琼脂平板。将离心后的脑脊液标本沉淀滴加至巧克力琼脂平板，取菌环划线接种。置5%的CO2孵箱或燃有蜡烛的烛缸中培养。也可将一些沉淀接种备用肉汤培养基（如脑心浸液肉汤培养基），进行孵育培养。如果用T-I培养基进行运输，在孵育24h后，用无菌的针或注射器转移100 µl T-I培养基的液体部分到BAP及CAP 上，并划线分离。

3. 脑脊液标本革兰染色（Hucker 改进方法）

脑脊液标本离心沉淀物革兰染色或采用乳胶凝集方法检测CSF中特殊的抗原成分两种检测方法，可作为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌引起的细菌性脑膜炎的初步诊断。即使标本培养阴性，革兰染色或乳胶凝集检测结果阳性或其中任何一个检测结果阳性即可以作为感染的证据。

（1）脑脊液标本离心，2000rpm，20min。

（2）酒精清洗并干燥的玻片，滴加1滴～2滴沉淀物，允许多滴汇集成一个大滴，不要铺开液体或使用过高浓度的沉淀物。可能的情况下，在生物安全柜中风干玻片。

（3）将玻片三次快速通过火焰以固定涂片，不应该灼干。也可以使用异丙醇（95％-100％）固定。

（4）草酸铵结晶紫染色玻片，1min。流水冲洗玻片1min，并去除多余的水分。

（5）革兰氏碘液染色玻片，1min。流水冲洗玻片并干燥。

（6）95%的乙醇脱色（5s-10s足够）。

（7）番红精复染20s-30s或用酚红复染10s-15s。流水冲洗玻片并拭干玻片。

显微镜观察染色的涂片，用亮视野的透镜和油镜。

脑膜炎奈瑟菌通常出现在多形核白细胞内或细胞外，革兰阴性、咖啡豆形双球菌。

（二）血液标本

1. 接种血培养瓶：采取血液标本后直接接种血培养瓶，应在培养前排气，放置在35℃，排气通常是在血培养瓶的橡胶部分插入一个塞有棉花的无菌针头来实现。

2.传代培养

（1）血培养瓶观察血培养瓶在培养14h～17h后开始进行观察，以后每天都要进行观察，直至第7天。红血球发生任何混浊或溶解都可能是细菌生长的指示，应该立即进行传代培养。脑膜炎奈瑟菌很脆弱，因此不管血培养瓶的表象是否变化，培养14h～17h、48h和7天时都应进行传代。出现浑浊和细菌生长二者并不一定有相关性，不出现浑浊并不意味着细菌一定没有生长。在传代前应搅动瓶子混匀内容物。

（2）血培养瓶培养物转种用乙醇和聚烯吡酮碘拭子消毒血培养瓶橡胶塞表面，用带针头的注射器从血培养瓶中吸取少量（0.5mL）液体，接种于巧克力琼脂平板（CAP）和血琼脂平板(BAP)。当只使用一种琼脂时，应该接种CAP，因为CAP含有流感嗜血杆菌生长所必需的因子，而BAP是没有的。划线方式接种琼脂平板，在CO2空气中培养至48h。当细菌的生长已经通过血琼脂传代而确定时，则不需要再继续培养血培养瓶。瓶子应该按照生物安全程序处理。

（三）、T-I培养基

T-I培养基接种标本后，培养24h，用无菌针头或注射器将100μl T-I培养基液体加至BAP和CAP上，划线，CO2空气中35℃培养至48h。可通过革兰染色检测生长物纯度。如果BAP或CAP琼脂上没有细菌生长，应分别在第3天和第7天再次进行传代培养。培养后的T-I培养瓶应该按照生物安全程序处理。

（四）、脑膜炎奈瑟菌形态学特征

BAP平板上的脑膜炎奈瑟菌新鲜菌落呈现圆形，光滑、湿润、光泽、中央凸起、有完整的边界，一些菌落与周围的菌落接合。培养物灰色，不产生色素，陈旧菌落变成灰色半透明，有时导致底部琼脂变暗。充分分开的菌落可以在18h