蛋白质工程第四讲分离纯化与分析优秀课件

T1→T11
图4 TLC色素指纹图谱的图像灰度分析曲线 Fig. 4 Intensity curve of pigment fingerprintings on TLC
➢ 重复展层法：展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：0.75-0.95： 0.2-0.30：0.8-1.0：0.25-0.35 ；展层剂2为石油醚：正己烷：异丙醇：丙酮，比例为10： 0.95：0.22-0.25：0.38-0.41 。
吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等 ➢ 柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、
病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、 皂苷类、类脂和色素等等。 ➢ 薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析 硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂； 硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤 维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)， 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化 测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做 展层剂，Rf大小苏丹黄>苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚 蓝Rf之差在0.1—0.2)。 分析程序：点样，展层，显色。
2、基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化）
3、分类：
初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等 精制纯化：
吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析
二、初级分离（要求：灵活运用） 目的——分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。 方法及原理：
➢ 为了保证分析的准确度，避免检测体系中某些物质的干扰，往往对样 品进行处理。
第一节 概述
二、分离分析的含义：
1、分离过程本身可以是分析过程 样品干扰严重，需通过分离再检查， 分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC）
2、分离过程的分析——优化纯化工艺 分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等
分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。
➢ 分离纯化过程即是分析检测过程：
电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等；
分析是对事物的感知，是眼睛、是手段
第二节 分离与纯化
一、概述 1、一般原理：
依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行 分离纯化。
➢ DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。
➢ Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰 酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10 nmol肽样品）。
3、基本要求：
客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。
4、分析方法要求： 选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等
三、如何理解分离纯化与分析（三个层次） ➢ 物质的分析离不开分离：
分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与 功能关系的分析；
➢ 物质分离纯化过程离不开分析检测：
蛋白质工程第四讲 分离纯化与分析
一、分离纯化是分析的重要过程：
➢ 针对分析目的不同，对分析对象的要求和采取的措施不同。
若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如： 抗原及其抗体检测，配体及其配基等。
多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、 动力学（变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分 析。
TLC 色素指纹图谱和灰度分析
T11 T10 Hale Waihona Puke 9T8T7 T6 T5
T1-4
a
b
图3色素的TLC指纹图谱 Fig. 3 Profile of pigments fingerprints on TLC a, Once Developing Method. b, Repeated Developing Method
1、沉淀分级分离： ➢ 盐析分级：中性盐（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白质类 ➢ 等电点分级： ➢ 有机溶剂： ➢ 热沉淀： ➢ 其它：
盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、 三氯乙酸、PEG、重金属等
➢ 联合使用：盐析—等电点
盐析原理示意图
2、膜分离： – 膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析 – 膜材料和特性： • 有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等） • 陶瓷膜：陶瓷材料 – 膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等 – 应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，
平推流。 （1）吸附分离技术：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附剂）—流动相（洗脱剂）
分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程（固相和流动 相之间连续分配的过程） 吸附剂：吸附剂的选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、 成本低廉。 吸附剂的选择：根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂 易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于 解吸附，对于极性大的分离对象，选择极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂 的选择依靠经验和多次试验。
➢ 重复展层法呈现的TLC指纹图谱能将CQV97菌株全色素分辨成11条不同颜色条带的色 素组分，从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、 红色、红棕色和橙黄色
聚酰胺薄膜薄层层析：
➢ DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），
➢ 灵敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下 反应。
膜生物反应器。
3、萃取： 4、离心：
– 分类：低速离心、高速离心、超速离心 – 分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度） 5、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等 6、联用方法：膜过滤-盐析—等电点，离心—萃取，离心-盐析—等电点等等
B：精制分离—色谱分离： （A）精制过程，纯度较高 （B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为