透射电子显微镜样品制作(下)

其它用品：
超薄切片专用镊子、氯仿、双面刀片、 滤纸、50ml烧杯、剪刀、角匙、100ml 广口棕色试剂瓶、双蒸水、放置铜网的 平皿 等等
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二、超薄切片方法
超薄切片的步骤： 1. 修块 2. 安装包埋块； 3. 安装玻璃刀； 4. 调节刀与组织块的距离与角度（对刀）； 5. 调节水槽液面高度与灯光位置； 6. 调节加热电流及切片速度，切片； 7. 将切片捞在有支持膜的载网上。
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LKB-V型热胀式切片机
主要构造： 电源控制箱 主机部分
LKB-V型热胀式切片机
电源控制箱：样品臂加热及冷却
样品臂的升降控制 样品臂运动的手动、自动模式 切削速度控制
主机部分
样品臂 —带加热线圈和样品定向头 刀台 —可调整前后左右方位及角度 动圈式马达 —可使样品臂上下往返运动 光源（荧光灯、聚光灯） —照明、检察刀刃 立体显微镜 —观察切片
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调节水槽液面高度与灯光位置
对完刀后，即可向刀槽内注入双蒸水或15%乙 醇溶液。开始可注入过量的液体并使液面成凸面， 以保持浸湿刀刃，然后，在显微镜下吸回一些液 体，当液面出现一反射光的亮面为止。
这个亮面不仅可以体现所需的水面，而且通过它 还可以观察切片的质量及估计切片的厚度。
调节刀与组织块的距离与角度 （对刀）
对刀是超薄切片过程中极为重要而又较难掌握的一环。
对刀时，操作者必须十分仔细。否则，将无法切出切片。
对刀的步骤：锁定样品杆和装刀后，先调整显微镜的位置及 刀的位置，使其能看清刀刃以及能看到样品块的位置，调整 样品面的位置让切面的两个平行边与刀刃平行。然后选择好 的刀刃段，用粗调进刀，直至在组织块的表面观察到影子 （反射像）时，仔细观察影子，并调整刀刃与样品面的角度， 使刀刃与样品面完全平行（此时影子是平行的且上下移动样 品块时影子经过样品面的范围的粗细是不变的），最后用细 调进刀，使影子呈一条几乎觉察不出来的狭缝为止。此时， 若使样品面在刀刃上下运动，则可看到刀刃刚刚接触到样品 面。
(1)孚尔瓦膜(Formvar Film)：配制0．2％—0．5％ 的孚尔瓦／氯仿溶液，用洁净光滑的载玻片浸入深约3cm， 稍停留一下即匀速取出，自然风干。再用锋利的针尖沿着 载玻片浸过溶液的那部分的边缘划一道痕。
事先准备好一个小玻璃缸，并注满清水。将载玻片倾 斜着（或垂直）缓缓插入水中，一片(或两片)透明的薄膜 就飘在水面上了。
整个过程都要注意防尘。
(2)火棉胶膜：准备一个小玻璃缸，注满重蒸 水，向液面上点滴1％一2％火棉胶／醋酸戊酯溶 液，随即展开形成一层透明的薄膜。为了防尘， 挑掉第一张膜，再如上重做一张膜。接着选择均 匀平展的部位轻轻摆上载网，如图所述捞起即可。
(3)碳膜：制备碳膜需用真空喷镀仪，常用扫描电镜 样品制备时用的真空喷镀仪制备碳膜
一般载网的外直径都是3mm 载网有正反面，光面为正
对于一般普通组织超薄切片，可选用200—300目 的载网；
对于过小的和过碎的样品，可选用400目的载网； 对于不易查找的样品，可选用带字母记号的载网，
以帮助记忆目标的位置等。
在使用之前，新网和旧网都需要进行清洗，清洗的目的除了 使载网洁净之外，还有除去载网的静电以便捞片的作用。 对于新的载网，直接用95％的乙醇或100%丙酮浸泡一下，再 用重蒸水冲洗后自然晾干即可。 清洗旧载网的方法： (1)氯仿法：用氯仿浸泡 (2)烧灼法：用乙醇火焰烧灼片刻 (3)浓硫酸法：用浓硫酸浸泡
切片用刀
超薄切片用到有两种： 钻石刀
由天然钻石加工而成 玻璃刀
使用玻璃制作而成
钻石刀
优点：质地坚硬，经久耐用 缺点：价格昂贵，而且容易损坏，需要小心保护。 切割对象：用来切割硬质样品，如金属、矿石、骨
骼、有厚细胞壁的植物材料。 生产厂家：奥地利的LKB和美国的RCM、SPI 使用：钻石刀无需制备，但使用前后都需要作适当
如果飘浮的膜显示五额六色或似白雾并有条纹，说明 膜过厚和不均匀，则弃之不用，再重新做，以免影响成像 的质量。
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接着再往薄膜上轻轻摆上载网，排列尽量均 匀，并用摄子逐一轻轻压一下，以粘牢，再用一 个干净的载玻片或一片滤纸轻轻压住膜一侧的边 缘，并顺势翻动，将膜连同载网一起捞出，放入 铺着滤纸的培养皿中自然晾干。
加热电流和切割速度 共同决定切割厚度 样品由下向上切割完 成后有退刀动作
20分钟左右的时间里，金属膨胀杆可保持均匀 而准确地线性膨胀。
为了使金属膨胀杆在切片过程中始终保持线性 膨胀状态，需要每切完一个样品后，利用换样 品的时间，打开吹风机冷却片刻。否则持续加 热会使金属膨胀杆失去原有的线性膨胀，切片 的厚薄就不均匀了。
切片机的工作基本原理： 1、热胀式切片机
利用金属杆热胀或冷缩时产 生的微小长度变化来提供推进 2、机械式切片机 用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进 我国使用较多的是瑞典LKB公司产品 随着机械加工水平提高，目前市场上新产品都是机械 式超薄切片机
我校为LKB公司的LKB-V型热胀式切片机
热胀式切片机的工作原理： 打开开关—金属膨胀杆内线圈通电—膨胀 杆加热—膨胀杆带动样品向前膨胀—马达 带动样品上下运动—样品经过刀口—切割
清洗好铜网后，应在铜网上覆盖一层薄膜，叫做支持膜 用以支持所要观察的各种样品。 厚约20nm 较常用的有：孚尔瓦膜、碳膜、火棉胶膜等。
孚尔瓦膜——它的支持力较强，但制备较复杂。 碳膜——分辨力高，化学性能稳定，机械强度也较高， 常用于加固其它膜。 火棉胶膜——机械强度较小，但容易制备。
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支持膜制备方法——
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超薄切片的制作
赵岩 上海海洋大学 水产与生命学院
透射电子显微镜使用电子束代替光线 透射电子显微镜对样品的要求： （1）样品薄或小 一般是数十纳米的薄片（<100nm）或小颗粒 超薄切片技术样品的厚度为40－70nm 制备硬标本块后超薄切片（最常规） （2）保持样品的精细结构
超薄切片
清洗
玻璃刀
优点：制作简便，价格低廉 缺点：刀刃较脆，不耐用。 切割对象：切割普通样品。 使用：适合初学者使用。
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玻璃刀
制刀用的玻璃是一种特制的硬质玻璃。 玻璃刀需现用现做，一般在使用前新鲜裁制，
以免沾染灰尘或碰坏，做好的玻璃刀在空气中 会有风化作用，玻璃内部的分子运动也会导致 刀刃变钝。 玻璃刀的制作，目前多用制刀机裁制。
修块
在进行超薄切片前，首先必须对包埋 块进行修整。
目的：使包埋块中组织暴露出来。 首先依样品的位置，将包埋块顶端削
平，露出组织，然后再削去周围的包 埋剂及无关的部分，把要观察的部分 修成锥体（但注意不要把锥体修得过 于突出，否则在切Biblioteka Baidu的过程中容易产 生振纹），并将顶端的平面修成边界 明显的平整的梯形（或方形）。
玻璃刀检查
按上述方法制成的玻璃刀，必须在解剖 镜下用聚光镜的投射光照射或用暗视 野显微镜下检查。
刀刃平整光滑无锯齿状波纹者适用。
玻璃刀水槽制作
经检查后的玻璃刀还须在刀上作 一小水槽（trough），以便在 切片时让切下来的超薄切片漂 浮在液面上。
水槽通常都是由预先成形的金属 片、塑料水槽或胶带制成。
切片厚度与颜色
<50nm
灰色
60-90nm 银灰色
90-150nm 金黄色
150-190nm 紫色
190-240nm 蓝色
240-280nm 绿色
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调节加热电流及切片速度，切片
在切片时，切片速度也是影响切片质量的 因素之一。通常使用2mm/s的切片速度， 稍硬的样品可使用较慢的速度（1mm/s或 更慢），但非常硬的样品，如金属和骨骼， 需要较快的速度（10mm/s或更快）。但 切片速度过快会增加样品的受挤压的程度， 而速度过慢会使切片难度加大，水槽液容 易沾湿刀背。
*染液配好后可使用半年左右，放置较久的 染液离心一下效果好
超薄切片的注意事项
超薄切片过程中，切片成功与否，对刀很 关键，所以对刀时，要仔细和耐心
刀槽中所用的蒸馏水可能是一个污染源。 所以尽可能用新鲜的蒸馏水（最好是双蒸 水），不要用去离子水，因为它常残留着 去离子时所用的交换树脂。此外，也应该 注意切片时的碎屑等对水槽造成的污染
如果刀刃浸湿和亮面无法同时满足时，可以在保 持刀浸湿的最低水面的情况下尝试调整灯的角度
注意当水面过高时，切片很难连接成带，而且样 品面和刀背容易沾湿。
调节加热电流及切片速度，切片
加水后，即可打开自动切片开关进行切片。 切片开始时，切片可稍厚一些（约8090nm）然后可根据切片的情况调节切片 速度和厚度，直至切出满意的切片。
为了防止漏水，水槽和玻璃刀相 接处须用石蜡或指甲油焊封。
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载网与支持膜
载网是用来捞超薄切片的，以便继续进行染色和观 察。市售有多种类型的载网供我们选择。
铜网 (常用) 不锈钢网(常用) 镍网 金网
*切片保存于样品盒
如果样品有特殊要求，如：做免疫电镜标记时，最好 选用化学惰性较大的金网和镍网，以减少其它化学 反应的干扰和对载网的锈蚀，从而提高样品的质量。
制刀机
制刀机操作简单，制出的刀合格率也比较 高。而且还可以根据需要制作出不同刀 角（knife angle）的玻璃刀。
我校电镜室为LKB切片机配套用LKB 7800型制刀机
玻璃刀的制作
制刀时，先将玻璃条洗净晾干，制成方块 （如作45°刀）或菱形块（如作35° 刀），然后，沿着稍偏离对角线的方向划 割，便可得到两把三角形的刀。
[目的]将样品切成厚度在100nm以内的薄 片，以便在电镜下观察
超薄切片技术的应用
超薄切片技术的应用：除了单独应用于 组织细胞的结构观察外，还可与放射性同位 素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位 杂交等技术结合，用于不同目的的研究。
内容： 超薄切片所用工具 超薄切片方法 造成超薄切片发生缺陷的因素 半薄切片简介 染色 负染色技术
安装包埋块
把修好的包埋块固定在定向头上，然后锁住样 品杆，把定向头固定在样品杆上。固定时，必 须使组织块切面的底边成水平放置，若是修成 梯形的切面要让长边在下方。此外，夹持器夹 着包埋块的位置应尽可能靠近样品面，以减少 切片时的振动。
安装玻璃刀
把装有水槽的刀插入到刀夹并固定。此时，刀边应 紧靠着刀夹的前缘，刀刃应与刀台上的标志杆等高， 并根据组织块软硬程度不同，调节切割角度 （cutting angle，是实际刀角（knife angle）和 刀间隙角（clearance angle）之和），当刀角已 经确定时，只能调节刀的间隙角，通常为4-5°， 如果是钻石刀可根据说明书中推荐的刀角来选择 （一般为6°左右）。
切片厚度与颜色
<50nm
灰色
60-90nm 银灰色
90-150nm 金黄色
150-190nm 紫色
190-240nm 蓝色
240-280nm 绿色
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一、超薄切片所用工具
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超薄切片机
目前有许多种型号的超薄切片机，但主 要包括两类：
1、热胀式切片机 如瑞典LKB公司产品
2、机械式切片机 如德国leica公司， 美国RMC公司
调节加热电流及切片速度，切片
切片机上虽然有切片厚度指示标志，但并非代表 切片的实际数值，可以结合切片在亮水面上的干 涉色来粗略估计切片的厚度。
这种颜色是由切片顶面反射的光波和与切片与水 的界面反射的光波之间的干涉所产生的。
切片过厚，实际上不能用于电镜观察。要获得较 好的图象，一般需要银白色到淡黄色的切片。
将切片捞在有支持膜的载网上
切片的捞取通常是用镊子夹住铜网，对准 液面上的切片轻轻一沾（有支持膜时，膜 面向下），使切片覆于铜网上，然后晾干 切片。
也可以用镊子夹住铜网，浸入水槽，先用 眼睫毛或钢针固定切片条的位置或先让切 片的一角轻轻贴附在铜网的一端，再把铜 网自下而上提起。此法操作难度较大，但 有利于捞取连续切片。
染色
[目的]将重金属原子结合到细胞结构上使 造成图像反差
常用染色液 重金属：铅盐（Pb）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚）
铀盐（U）大多数细胞成分均可
醋酸铀（黄色有毒晶体，见光分解）5070%乙醇饱和溶液，放置过夜，避光（棕 色磨口瓶，黑纸罩上）取上清
柠檬酸铅（有毒）
醋酸铀30分钟，漂洗
柠檬酸铅3~7分钟（不宜过长），避CO2 （水去CO2，口吹，NaOH 颗粒）漂洗