大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验

大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验摘要大肠杆菌自家灭活油乳苗的制备及疫苗质量检验研究结
果表明，按乳化剂的亲水亲油平衡值设计4个配方，通过对乳化剂粘度测定、乳剂类型测定、稳定性测定得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80、1%硬脂酸铝。

以此配方作为免疫佐剂，制备自家灭活油乳苗，并对其质量进行检验。

经检验合格后，采用流行病学方法评价疫苗的免疫接种效果。

结果表明，自家苗对试验动物小白鼠有保护力。

关键词大肠杆菌；灭活油乳苗；制备；疫苗质量；检验
中图分类号 s852.5+2 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）05-0274-01
大肠杆菌为肠杆菌科、埃希菌属，兼性厌氧菌，为革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。

由echerich于1885年发现。

在相当长的时期内，一直被视为正常菌群。

直到20世纪中叶，人们才认识到一些特殊血清型对人和动物有致病性。

大肠杆菌血清型较多，各血清型之间没有交叉免疫力，菌株易发生变异，因此市售大肠杆菌疫苗无法覆盖所有致病性大肠杆菌血清型。

自家疫苗针对性强，在未引入外来畜禽前能收到较好的免疫效果。

因此，及时分离到菌株，制取自家灭活疫苗来免疫畜禽是一种经济、效果好的预防致病性大肠杆菌的措施。

1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要试剂。

营养肉汤、minca培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐（t.g）培养基、酪胨琼脂（g.a）培养基、葡萄糖蛋白胨水（g.p）培养基、白油、司本-80、吐温-80、硬脂酸铝、0.85%生理盐水，甲醛溶液，麦氏浊管。

1.1.2 仪器。

胶体磨、电子天平、精密试纸、hy-8大容量振荡器、pgx型多段可编程光照培养箱、电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、sw-cj-1fd型单人单面净化工作台、tdl-40b离心机、冰箱、离心管。

1.2 试验方法
1.2.1 乳化剂配方的优化。

乳化剂配方设计根据乳化剂的亲水亲油平衡值，固定亲油性乳化剂司本-80，改变亲水性乳化剂吐温-80，设计4种乳化剂配方（表1），并与等量生理盐水乳化。

用乳化剂检验方法检验后确定最佳配方。

1.2.2 自家苗制备。

①菌种毒力试验。

将大肠杆菌接种于普通营养肉汤中培养24 h，用麦氏浊管法大概计算出含菌数，给小白鼠进行腹腔注射，观察小白鼠发病情况。

②菌种复壮。

将冻存的大肠杆菌菌种接种于普通营养琼脂板中，置37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h。

③菌种扩大繁殖及灭活。

用接种环从普通营养琼脂板中挑取菌落接种于普通营养肉汤中混匀，置37 ℃电热恒温培养箱中培养24 h。

按改良minca培养基量的3%～5%接种于改良minca培养
基中，37 ℃通气培养6～8 h。

根据麦氏浊法计算出含菌数大约为10亿个/ml。

向菌液中加入0.3%～0.4%甲醛溶液37 ℃灭活24～48 h。

④灭活检查。

用接种环接种已灭活的菌液于麦康凯培养基中，观察有无细菌生长。

⑤配苗。

按优化出的乳化剂配方，依灭活菌液的量，采用剂在油中法来配制佐剂。

将佐剂加热溶解，经121 ℃高压灭菌30 min，冷却后4 ℃保存备用。

⑥乳化。

量取灭活菌液250 ml，倒入胶体磨内，缓慢搅拌，边搅拌边缓慢加入佐剂250 ml，在胶体磨内高速乳化10 min。

⑦分装。

用已高压灭菌过的10 ml青霉素瓶分装。

用石蜡封好口4 ℃保存备用。

1.2.3 自家苗质量检验。

①剂型检验。

用吸管吸取疫苗，滴几滴于水中，观察是否分散。

②粒度检验。

用显微镜直接观察颗粒是否均匀。

③稳定性检验。

在一个半径为10 cm的离心器中装油乳剂，3 000 r/min离心15 min不分层，相当于保存1年以上不破乳。

④粘度检验。

取内口直径为1.2 mm的吸管，在室温下吸满1 ml乳剂，垂直放出0.4 ml所需时间作为粘度单位，以2～6 s为合格，不得多余10～15 s。

⑤无菌检验。

取灭活苗1 ml，接种于t.g培养基上，于37 ℃培养3 d后，吸取培养物，分别接种于t.g和g.a斜面，每支0.2 ml，一支置37 ℃，一支置25 ℃。

另取0.2 ml接种于g.p培养基，于25 ℃培养5 d，观察是否有细菌生长。

⑥安全性检验。

取10只18～20 g的小白鼠，每只腹腔注射疫苗1 ml，观察21 d。

1.2.4 疫苗免疫效果评价。

取20只18～20 g的小白鼠，平均分为2组，每组10只，同等饲养条件。

试验组每只腹腔注射疫苗0.2 ml，对照组每只注射生理盐水0.2 ml。

14 d后，进行第2次免疫。

7 d后对2组小白鼠进行强毒攻击，每只腹腔注射0.5 ml保存的大肠杆菌原液。

2 结果与分析
2.1 乳化剂配方的优化结果
按照王明俊[2]介绍的乳化剂检验方法，得出最佳乳化剂配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80、1%硬脂酸铝。

2.2 灭活菌液检验结果
灭活后的菌液接种于麦康凯培养基中，无任何细菌生长，说明灭活彻底。

2.3 自家苗质量检验结果
2.3.1 剂型检验、粒度检验、粘度检验、稳定性检验。

疫苗为乳白色的油包水型乳剂，粘度低，颗粒大小均匀，稳定性好，适宜注射。

2.3.2 无菌检验。

将疫苗分别接种于t.g培养基和g.a培养基斜面37 ℃培养，t.g培养基和g.a培养基斜面，g.p培养基上（25 ℃）分别培养5 d，观察无任何细菌生长。

说明制苗过程中注意无菌操作，疫苗未被污染。

2.3.3 安全性检验。

从注射疫苗到21d后小白鼠无不良反应，
无死亡，全部健活。

结果表明，自制疫苗比较安全。

2.4 疫苗免疫接种效果评价
对免疫苗免疫接种效果进行评价，结果见表2。

通过计算，疫苗保护率为90%，疫苗指数为10；疫苗免疫效果较好。

3 结论与讨论
乳化剂配比是油乳苗质量好坏的关键因素之一。

不同的乳化剂配方决定了制出的乳化剂的性状和稳定性。

乳化剂的配比是根据每种乳剂的亲水亲油平衡值（hlb值）来定。

每一种乳剂都有一定的亲水亲油平衡值，亲水性强的乳化剂，容易形成水包油型乳剂，亲油性强的乳化剂，容易形成油包水型乳剂。

水包油型乳剂稀薄，注入机体后易于分散，但佐剂活性低，一般不采用。

油包水型乳化剂比较粘稠，在机体内不易分散，但佐剂活性较好，为生物制品所采用的主要剂型[2]。

通过乳剂类型检验、粘度测定和稳定性测定结果，可得4种配方中最佳配方为90%白油、10%司本-80、2.0%吐温-80和1%硬脂酸铝。

而且制出的疫苗为乳白色的油包水型乳剂，粘度低、颗粒大小均匀，稳定性好。

佐剂是可以增强抗原特异性免疫应答的物质。

据李增魁等[3]报道，即使是同样的抗原产生的抗体水平不同。

以矿物油佐剂疫苗为最高，氢氧化铝佐剂疫苗次之，不含佐剂疫苗的抗体水平最低。

杜银忠等[4]试验结果也与李增魁等的结果相同。

4 参考文献
[1] 陆承平.兽医微生物学[m].北京：中国农业出版社，2001：121-125.
[2] 王明俊.兽医生物制品学[m] .北京：中国农业出版社，1997：149-153.
[3] 李增魁，李英.不同免疫佐剂对大肠杆菌疫苗免疫效果的影响[j].青海大学学报：自然科学版，2008，26（3）：27-28.
[4] 杜银忠，杨增岐.不同佐剂大肠杆菌疫苗对免疫效果的影响[j].中国畜牧兽医，2007，34（3）：96-97.。