12 分光光度分析法
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第12章 分光光度法
12.1 概述 12.1.1定义 分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分 析方法，包括比色法、可见及紫外分光光度法及红外光谱法 等。我们重点讨论可见光区的分光光度法。
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2012年9月17日
12.1.2 分光光度法的特点 a 灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为1%~105的微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6~10-8的痕 量组分。 b 准确度较高。目视比色法的相对误差为5%~10%， 分光光度法为2%~5%。 c 应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物 都可以直接或间接地用目视比色法或分光光度法进行测 定。 d 仪器简单、操作简便、快速。
cb : ? mol / 1000 cm
cb 1000
cb 0 . 001
2
M 10
6
cbM 10 (? g / cm ) S
3 2
S cbM 10
3
0 . 001
M 10
3
M
( g / cm )
2
桑德尔灵敏度越小，表示显色反应越灵敏。
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（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物 或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗 伯—比尔定律。
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12.3 光度分析的方法和仪器 12.3.1 目视比色法 用眼睛观察、从管口垂直向下观察（比色管），比较待 测溶液和标准溶液颜色的深浅，以确定物质含量的方法。 优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析。 灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故某些显 色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。 主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测 定时临时配制。
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12.3.2 标准曲线法 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制 标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被 测物质的浓度或含量。
特点：入射光是纯度较高的单色光，故使偏离朗伯-比 尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大， 分析结果的准确度较高。
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不平坦
（1）非单色光引起的偏离 * 朗伯-比尔定律只适用于单色光， 但由于单色器色散能力的限制和 出口狭缝需要保持一定的宽度， 所以目前各种分光光度计得到的 入射光实际上都是具有某一波段 的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同，因而导致 对朗伯－比尔定律的偏离。
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12.1.3 溶液的颜色与光吸收的关系
光是一种电磁波。根据波长或频率排列，得到如表的电磁 波谱表。
表 电磁波谱范围表
光谱名称 x射 线 远紫外光 近紫外光 可 见光 近红外光 中红外光 远红外光 微 波 无线电波 波长范围 -1 10 ～l0nm 10～200nm 200～400nm 400～750nm 0.75～2.5μ m 2.5～5.0μ m 5.0～1000μ m 0.1～100cm 1～1000m 跃迁类型 辐 射 源 K 和 L 层电子 x 射线管 中层电子 氢、氘、氙灯 价电子 氢、氘、氙灯 价电子 钨灯 分子振动 碳化硅热棒 分子振动 碳化硅热棒 分子转动和振动 碳化硅热棒 分子转动 电磁波发生器 分析方法 x 射线光谱法 真空紫外光度法 紫外光度法 比色及可见光度法 近红外光度法 中红外光度法 远红外光度法 微波光谱法 核磁共振光谱法
T It I0
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I0 Ia It
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朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)分别于1760和1852年 研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定量关系， 二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。 当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到长度为b的液层、 浓度为c的溶液时，由于溶液中吸光质点(分子或离子)的吸 收，通过溶液后光的强度减弱为I：
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12.3.3 二元混合组分的测定 因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光度的加和 性，同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光 的波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或可 见光区域内有吸收峰，都可以测定。
A
A
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1 相关概念 *吸收光谱：原子吸收光谱 和分子吸收光谱。是因物 质对不同波长的光具有选 择性吸收作用而产生的。 * 单色光：具同一波长的光。 * 复合光：由不同波长组成 的光。*
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12.2.3 对朗伯-比尔定律的偏离 在分光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况， 特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向 浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗 伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较 大的误差。 偏离朗伯－比尔定律的原因主 要是仪器或溶液的实际条件与朗 伯-比尔定律所要求的理想条件不 一致。
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* 紫外光：波长200~400 nm。 * 可见光：人眼能感觉到的光，波长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各 种色光按一定比例混合而成的。 * 波段：各种色光的波长范围不同。 * 互补色光：按一定比例混合，得到白光。 * 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性 吸收作用而产生的。
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（2）介质不均匀引起的偏离 朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被 测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光 通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射 现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标 准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶 液产生胶体或混浊。
1 2
1
A A bc 1 bc 2
1 2 1 2
1 1 1 1
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2
A A bc 1 bc 2
1 2 1 2
2 2 2 2
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12.3.4 分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光 光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光 光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光 束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示的单光 束、可见分光光度计。 分光光度计的基本部件:光源、单色器、比色皿、检 测器和显示装臵。
A bc
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例 浓度为25.5μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草 酰二腙光度法测定，在波长600nm处用2cm比色皿测量 A=0.297，计算摩尔吸光系数。 解：
[ Cu
2
]
25 . 5 10 50 10
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在可见光，KMnO4溶液对 波长525 nm附近绿色光的吸 收最强，而对紫色和红色的 吸收很弱。λmax=525 nm。 浓度不同时，光吸收曲线 形状相同，λmax不变，吸光 度不同。
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2 波长与颜色的关系
物质颜色
黄 绿 黄 橙 红 紫 红 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 吸 颜 色 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 绿 黄 绿 黄 橙 红 收 光 波长范围λ /nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
较平坦
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* 克服非单色光引起的偏离的措施 ◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”， 使标准曲线有较宽的线性范围。 ◎ 入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较 高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波 长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的 偏离要比在其他波长处小得多。 ◎ 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线 的线性范围内。
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12.2 光吸收基本定律 12.2.1 朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液 体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一 部分被器皿的表面反射。如图所示，设入射光强度为I0 ， 吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。
I0 Ia It Ir
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在分光光度分析法中，试液和空白溶液分别臵于同样质 料及厚度的吸收池中，然后让强度为I0的单色光分别通过 这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强 度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。 透光度或透光率 透过光强度It与入射光强度Io之比称为透光度或透光率， 用T表示溶液的透光度愈大，表示它对光的吸收愈小;相 反，透光度愈小，表示它对光的吸收愈大。
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* 吸收光谱曲线或光吸收曲线： 以波长为横坐标，吸光度 为纵坐标作图。 * 最大吸收波长：光吸收程度 最 大 充 处 的 波 长 ， 用 λmax 表示。 * 吸光度A(也称消光度E或光 密度D)：溶液对光的吸收 程度。
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3
6
63 . 55 2
8 . 0 10
4
6
mol . L
1
1
A bc
0 . 297 8 . 0 10
6
1 . 9 10 L .mol
.cm
1
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* 桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) S 指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内 所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg· cm 2，S与ε及吸光物质摩尔质量M的关系为：
A总 A1 A 2 A n
这一规律称吸光度的加和性。
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12.2.2 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 * 摩尔吸收系数 当浓度c用mol·-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K L 用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为 L· -l· -1，它表示物质的量浓度为l mol·-1，液层厚 mol cm L 度为l cm时溶液的吸光度。
A lg Io I Kbc
A lg Io I lg 1 T
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朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸光物质的 溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正 比。这是进行定量分析的理论基础。 比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素 有关。 含有多种吸光物质的溶液，如果各吸光物质对某一波长的 单色光均有吸收作用，且各吸光物质的吸光质点之间相互不 发生化学反应，则：
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光源
单色器
样品池
显示装置
检测器
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*光源 光源的作用是提供辐射--连续复合光 可见光区 钨灯 320-2500nm 优点：发射强度大、使用寿命长 紫外光区 氢灯或氘灯 180-375nm 氘灯的发射强度比氢灯大4倍 玻璃对这一波长有强吸收，必须用石英光窗。 紫外-可见分光光度计同时具有可见和紫外两种光源。
12.1 概述 12.1.1定义 分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分 析方法，包括比色法、可见及紫外分光光度法及红外光谱法 等。我们重点讨论可见光区的分光光度法。
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12.1.2 分光光度法的特点 a 灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为1%~105的微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6~10-8的痕 量组分。 b 准确度较高。目视比色法的相对误差为5%~10%， 分光光度法为2%~5%。 c 应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物 都可以直接或间接地用目视比色法或分光光度法进行测 定。 d 仪器简单、操作简便、快速。
cb : ? mol / 1000 cm
cb 1000
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桑德尔灵敏度越小，表示显色反应越灵敏。
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（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物 或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗 伯—比尔定律。
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12.3 光度分析的方法和仪器 12.3.1 目视比色法 用眼睛观察、从管口垂直向下观察（比色管），比较待 测溶液和标准溶液颜色的深浅，以确定物质含量的方法。 优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析。 灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故某些显 色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。 主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测 定时临时配制。
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12.3.2 标准曲线法 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制 标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被 测物质的浓度或含量。
特点：入射光是纯度较高的单色光，故使偏离朗伯-比 尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大， 分析结果的准确度较高。
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（1）非单色光引起的偏离 * 朗伯-比尔定律只适用于单色光， 但由于单色器色散能力的限制和 出口狭缝需要保持一定的宽度， 所以目前各种分光光度计得到的 入射光实际上都是具有某一波段 的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同，因而导致 对朗伯－比尔定律的偏离。
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12.1.3 溶液的颜色与光吸收的关系
光是一种电磁波。根据波长或频率排列，得到如表的电磁 波谱表。
表 电磁波谱范围表
光谱名称 x射 线 远紫外光 近紫外光 可 见光 近红外光 中红外光 远红外光 微 波 无线电波 波长范围 -1 10 ～l0nm 10～200nm 200～400nm 400～750nm 0.75～2.5μ m 2.5～5.0μ m 5.0～1000μ m 0.1～100cm 1～1000m 跃迁类型 辐 射 源 K 和 L 层电子 x 射线管 中层电子 氢、氘、氙灯 价电子 氢、氘、氙灯 价电子 钨灯 分子振动 碳化硅热棒 分子振动 碳化硅热棒 分子转动和振动 碳化硅热棒 分子转动 电磁波发生器 分析方法 x 射线光谱法 真空紫外光度法 紫外光度法 比色及可见光度法 近红外光度法 中红外光度法 远红外光度法 微波光谱法 核磁共振光谱法
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朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)分别于1760和1852年 研究了光的吸收与溶液层的厚度及溶液浓度的定量关系， 二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。 当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到长度为b的液层、 浓度为c的溶液时，由于溶液中吸光质点(分子或离子)的吸 收，通过溶液后光的强度减弱为I：
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12.3.3 二元混合组分的测定 因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光度的加和 性，同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光 的波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或可 见光区域内有吸收峰，都可以测定。
A
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1 相关概念 *吸收光谱：原子吸收光谱 和分子吸收光谱。是因物 质对不同波长的光具有选 择性吸收作用而产生的。 * 单色光：具同一波长的光。 * 复合光：由不同波长组成 的光。*
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12.2.3 对朗伯-比尔定律的偏离 在分光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况， 特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向 浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗 伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较 大的误差。 偏离朗伯－比尔定律的原因主 要是仪器或溶液的实际条件与朗 伯-比尔定律所要求的理想条件不 一致。
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* 紫外光：波长200~400 nm。 * 可见光：人眼能感觉到的光，波长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各 种色光按一定比例混合而成的。 * 波段：各种色光的波长范围不同。 * 互补色光：按一定比例混合，得到白光。 * 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性 吸收作用而产生的。
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（2）介质不均匀引起的偏离 朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被 测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光 通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射 现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标 准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶 液产生胶体或混浊。
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A A bc 1 bc 2
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A A bc 1 bc 2
1 2 1 2
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12.3.4 分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光 光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光 光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光 束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示的单光 束、可见分光光度计。 分光光度计的基本部件:光源、单色器、比色皿、检 测器和显示装臵。
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例 浓度为25.5μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草 酰二腙光度法测定，在波长600nm处用2cm比色皿测量 A=0.297，计算摩尔吸光系数。 解：
[ Cu
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25 . 5 10 50 10
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在可见光，KMnO4溶液对 波长525 nm附近绿色光的吸 收最强，而对紫色和红色的 吸收很弱。λmax=525 nm。 浓度不同时，光吸收曲线 形状相同，λmax不变，吸光 度不同。
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2 波长与颜色的关系
物质颜色
黄 绿 黄 橙 红 紫 红 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 吸 颜 色 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 绿 黄 绿 黄 橙 红 收 光 波长范围λ /nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
较平坦
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* 克服非单色光引起的偏离的措施 ◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”， 使标准曲线有较宽的线性范围。 ◎ 入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较 高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波 长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的 偏离要比在其他波长处小得多。 ◎ 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线 的线性范围内。
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12.2 光吸收基本定律 12.2.1 朗伯-比尔定律 当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液 体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一 部分被器皿的表面反射。如图所示，设入射光强度为I0 ， 吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。
I0 Ia It Ir
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在分光光度分析法中，试液和空白溶液分别臵于同样质 料及厚度的吸收池中，然后让强度为I0的单色光分别通过 这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强 度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。 透光度或透光率 透过光强度It与入射光强度Io之比称为透光度或透光率， 用T表示溶液的透光度愈大，表示它对光的吸收愈小;相 反，透光度愈小，表示它对光的吸收愈大。
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* 吸收光谱曲线或光吸收曲线： 以波长为横坐标，吸光度 为纵坐标作图。 * 最大吸收波长：光吸收程度 最 大 充 处 的 波 长 ， 用 λmax 表示。 * 吸光度A(也称消光度E或光 密度D)：溶液对光的吸收 程度。
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mol . L
1
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0 . 297 8 . 0 10
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1 . 9 10 L .mol
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* 桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) S 指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内 所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg· cm 2，S与ε及吸光物质摩尔质量M的关系为：
A总 A1 A 2 A n
这一规律称吸光度的加和性。
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12.2.2 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 * 摩尔吸收系数 当浓度c用mol·-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K L 用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为 L· -l· -1，它表示物质的量浓度为l mol·-1，液层厚 mol cm L 度为l cm时溶液的吸光度。
A lg Io I Kbc
A lg Io I lg 1 T
重庆大学化学化工学院
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2012年9月17日
朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸光物质的 溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正 比。这是进行定量分析的理论基础。 比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素 有关。 含有多种吸光物质的溶液，如果各吸光物质对某一波长的 单色光均有吸收作用，且各吸光物质的吸光质点之间相互不 发生化学反应，则：
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光源
单色器
样品池
显示装置
检测器
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*光源 光源的作用是提供辐射--连续复合光 可见光区 钨灯 320-2500nm 优点：发射强度大、使用寿命长 紫外光区 氢灯或氘灯 180-375nm 氘灯的发射强度比氢灯大4倍 玻璃对这一波长有强吸收，必须用石英光窗。 紫外-可见分光光度计同时具有可见和紫外两种光源。