人乳铁蛋白转基因研究进展

*基金项目:国家高技术研究与发展计划(863)重大专项(2002AA206111)资助。

赵春江，男，1970年生，中国农业大学生物学院博士后。

E-mail:<chunjiangzhao@>.**通迅作者。

Author for correspondence.E-mail:<ninglbau@>.收稿日期：2003-05-19接受日期：2003-09-17农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(4):470~475·综述·人乳铁蛋白转基因研究进展*赵春江刘兆良樊宝良李宁**(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100094)摘要：人乳铁蛋白是一种具有多种生理功能的糖基化蛋白，可可逆性地结合两个铁离子。

概述了人乳铁蛋白的结构和理化性质，以及乳铁蛋白基因的结构，并着重论述了人乳铁蛋白转基因研究的状况和主要研究成果。

在此基础上，提出了尚未解决的问题，并展望了人乳铁蛋白转基因研究的前景。

关键词：人乳铁蛋白；人乳铁蛋白基因；重组人乳铁蛋白Study Progress of Human Lactoferrin TransgeneZHAO Chun-JiangLIU Zhao-Liang FAN Bao-Liang LI Ning**(State Key Laboratory for Agrobiotechnology,China Agricultural University,Beijing 100094,China)The human lactoferrin (hLF)is an iron-binding glycoprotein with muti-functions,including broad spectrum antimicro-bial activity and anti-inflammatory and immunoregulatory activities.In the review,the protein and gene structures and their physical and chemical properties of hLF were briefed.The main achievements of hLF transgenic study were assessed in detail.On the basis of the assessment,the aspects in the study which need more efforts to be investigated werepresented.human lactoferrin;human lactoferrin gene;recombinant human lactoferrin人乳铁蛋白（human lactoferrin ，hLF ）是一种属于铁结合蛋白家族的糖基化蛋白[1]，由Sorensen 和Heremans [2]首次发现，并由Blanc 和Isliker 命名。

乳铁蛋白可以可逆性地结合两个铁离子，其离子结合强度是运铁蛋白（在体内对铁起运输作用的主要蛋白）的300倍[3]。

人乳铁蛋白由692个氨基酸组成，分子量约为80kD [4]。

在乳铁蛋白内有2个具有铁离子结合能力的叶状结构，一个是氨基端区，即N-lobe ，另一个为羧基端区，即C-lobe [5]。

两区间有40％的同源氨基酸序列。

每个区能结合一个铁离子，同时结合1个二价炭酸根阴离子。

人乳铁蛋白为N 端连接的糖基所修饰。

经酶促反应，一个寡聚糖苷链以共价键结合在以Asn-Xaa-Thr/Ser 顺序排列的天冬酰胺酸残基上[6]。

人乳铁蛋白有3个可能被糖基化的位点，分别位于C 叶的第138的天冬酰胺酸残基、N 叶的第479、624天冬酰胺酸残基上[4]。

在3个位点中，位于138、479的天冬酰胺酸残基优先被糖基化，第624的天冬酰胺酸残基的糖基化受第479位天冬酰胺酸残基糖基化的限制[7]。

乳铁蛋白广泛存在于哺乳动物的体液和嗜中性粒细胞的次级颗粒中，乳铁蛋白具有的生理功能主要包括：广谱的抗菌功能、抗炎症功能和免疫生理调节功能[8]。

这些功能是通过乳铁蛋白直接获取铁离子或结合在细胞表面而使菌体细胞通透性增加实现的[9]。

乳铁蛋白可结合发生炎症区域的铁离子，从而阻止游离的铁离子参与催化有害的氧化反应。

乳铁蛋白同时也能影响T 细胞的扩增反应[10]。

一些研究表明，乳铁蛋白在体内的抗菌作用远比体外强。

这可能是由于乳铁蛋白上存在着抑菌和潜在的免疫调节功能区。

在体内，乳铁蛋白通过与体内的细胞结合而发挥抗菌和免疫调节作用[11]。

人乳铁蛋白的许多生理功能的发挥有赖于与特异性细胞受体的结合[12]。

现已发现人乳铁蛋白受体存在于多种细胞，如肠细胞、血小板、哺乳动物上皮细胞、淋巴细胞等[13,14]。

其它人乳铁蛋白潜在第4期赵春江等:人乳铁蛋白转基因研究进展的功能还包括对骨髓细胞生成的调节、有氧代谢的产生[15]、生长因子作用、DNA结合功能[16]、RNA酶功能等。

但乳铁蛋白的某些生物学功能还不甚明了，尚有待于进一步的研究工作阐明。

人乳铁蛋白的多功能属性引发了人们对其编码基因的研究，以便在此基础上对该蛋白进行大规模生产。

Powell和Ogden[17]、Rey[18]等在1990年首次分别发表了人乳铁蛋白的cDNA序列和部分基因组序列。

后来的研究表明，人乳铁蛋白基因位于人的第3号染色体q21-q23的位置，全长约35kb，共有17个外显子组成，内含子的大小在300bp~3.3kb之间[19]。

基于人乳铁蛋白基因的研究，许多研究者开始致力于这一转基因的研究，以了解通过转基因的方式大量生产重组人乳铁蛋白的可能性及重组人乳铁蛋白的性质。

人乳铁蛋白转基因研究的最终目的是通过转基因技术生产大量功能上与人乳铁蛋白相同或相近的重组人乳铁蛋白，使之为人类造福。

本综述的目的在于归纳和总结过去大约10年内在人乳铁蛋白转基因领域的研究成果和研究进展，以便为开展该方面的工作提供参考。

1人乳铁蛋白转基因研究过去人们曾以真菌、酵母菌、植物、动物细胞系和动物为宿主进行了人乳铁蛋白的转基因研究。

表１概括了该方面研究的情况。

在过去的研究中，人乳铁蛋白cDNA曾广泛用于各类转基因研究中。

这主要是因为人乳铁蛋白cDNA比基因组全序列基因更易获得，由于cDNA 序列较短，也更易于被构建到表达载体中去。

同时，cDNA可用于原核生物的表达，也使它较早地被用于转基因研究中。

Ling和Richardson[22]1993年首次报道了重组人乳铁蛋白在酵母菌中表达的研究。

在该研究中，人乳铁蛋白和酵母菌蔗糖酶信号序列区分别用于引导重组人乳铁蛋白的分泌。

含酵母菌蔗糖酶信号序列的酵母菌有较高的重组人乳铁蛋白表达量，而含人乳铁蛋白信号序列的酵母菌则重组人乳铁蛋白的表达量很低。

在真菌中，菌种在自然条件下分泌糖基化蛋白，这种属性使它成为一种理想的表达重组糖基化蛋白的宿主[32]，现在它已经用于糖基化蛋白的商业化生产[33]。

已经有用人乳铁蛋白基因转化真菌和的报道[20,21]。

在此两项研究中，在宿主中高表达的基因的启动子用于引导重组人乳铁蛋白的表达。

在中，人乳铁蛋白cDNA和在高效表达的葡糖糖化酶基因连接在一起，中间用KEX-2切割位点隔开。

经过翻译，融合蛋白用KEX-2切割，形成单独的重组人乳铁蛋白。

在此研究中，在表达重组人乳铁蛋白的转化子中引入突变，可获得较高的重组人乳铁蛋白的表达量(2000μg/mL)。

此表达量是迄今为止在酵母菌、真菌和细胞系的人乳铁蛋白转基因研究中重组人乳铁蛋白表达量最高的[19~24]。

这可能是因为采用了融合的方法进行转染并把作为转基因宿主的缘故。

根据以往研究的结果，转基因所用宿主、启动子和分泌信号区序列显著影响着重组人乳铁蛋白在酵母菌、真菌和细胞系中的表达水平。

由于人乳铁蛋白抗菌的作用，影响了一些酵母菌和真菌的正常生长，在培养后达不到较高的浓度，它们的生长被分泌的重组人乳铁蛋白所抑制。

这样，选择对重组人乳铁蛋白抑菌作用不敏感的细菌就显得很重要。

当转基因寄主的自身基因的启动子和信号区序列用于转基因研究时，往往会得到较高的外分泌重组人乳铁蛋白的表达水平。

到目前为止，还没有人乳铁蛋白全基因在真菌和细胞系内进行转基因研究的报道。

在这方面还有待进一步的研究。

对植物进行乳铁蛋白转基因研究的最初目地是生产大量的重组人乳铁蛋白并增强植物对细菌、真菌以及酵母菌的抵抗能力。

对重组人乳铁蛋白在烟草和土豆中的表达已有报道[25,26]。

在这些研究中，人乳铁蛋白cDNA和CaMV的启动子整合在一起对植株进行转化，重组人乳铁蛋白在植株中得到了正确表达。

但在实验中对植株抗病菌能力的提高尚未有报道，在这方面尚有待于进一步的研究证实。

人乳铁蛋白基因组全序列在植物中转基因的研究尚未有报道。

1993年，Platenburg等[27]首次报道了人乳铁蛋白基因转基因小鼠获得了成功。

早期该领域的研究仅局限于人乳铁蛋白cDNA。

后来的研究发现，携带有人乳铁蛋白基因组全序列的转基因小鼠分泌的重组人乳铁蛋白的量远高于携带有人乳铁蛋白cDNA的量。

1997年Nuijens等[28]分别用人乳铁蛋白cDNA和人乳铁蛋白全基因组序列片段与ALPHAs1-casein基因启动子相连接构建成乳腺组织特异性表达载体。

结果显示，cDNA转基因小鼠重组人乳铁蛋白的表达范围为400~1300μg/mL，而在基因组全基因片段的转基因小鼠中为300~3800μg/mL。

1999年Kim等[31]进行的转基因实验中显示，在同时用Beta-casein作为启动子的情况下，含人乳铁蛋白基因全序列片段的转基因小鼠的泌乳量471农业生物技术学报2004年表1人乳铁蛋白转基因研究的概况Table 1The outline of the hLF transgenic study1)The total amount of rhLF (recombinant human lactoferrin )is produced at levels up to 5μg/mL.Approximately 30%of the rhLF produced in this system is secreted into the growth medium;2)In the research,two expression vectors were constructed.The one contained yeast invertase signal sequence (pLFIS10)secreted rhLf with 1.5~2.0μg/mL while another containing hLF secretion signal sequence (pRL1)produced quite low level of rhLF in the yeast culture medium.The rhLF contents in colonies containing pLFIS10and pRL1were estimated to be 20~30μg/mL.The recombinent hLF concentration was detected by scanning the Western blotting film with an enhanced laser densitometer;3)(1)The expression level of rhLF of the transgenic plant containing hLF signal peptide sequence.(2)The expression level of rhLF of the transgenic plant containing sweet potato sporamin signal peptide sequence;4)0.01%of total soluble protein for Mas p2promoter and 0.1%of total soluble protein for CaMV 35S promoter;5)This is an unpublished research work mentioned by J.Platenburg in 1993.The exact expression level was not reported.;6)The rhLF concentrations in the milk from the hLF cDNA transgenic mice ranged from 400~1300μg/mL and they were 300to 3800μg/mL in the genomic hLF gene transgenic mice;7)The expression level of the protein in milk of 7mice ranged from 1~200μg/mL;1~34μg/mL in 6mice and 200μg/mL in 1mouse;8)In the research,the amount of the protein in 5transgenic mice ranged from 60~6600g/mL judged by ELISA analysis.Among them,3mice expressed theprotein at the level higher than 500μg/mL;9)The rhLF expression levels in 3out of 9offspring of 4transgenic cattle harboring genomicgene were 300~900μg/mL,and the levels in other 6offspring ranged from 1600~2800μg/mL;10)In the study,the rhLF expression levels of 7transgenic mice (2offsprings of the transgenic mouse were included)varied from 400~7,800μg/mL.six out of the 7mice had the rhLF expression levels over 1000μg/mL.A daughter of a hLF transgenic male mouse had the highest rhLF expression.转基因宿主基因序列启动子rhLF 表达水平作者及发表年代Transgenic host sequence Promoter rhLF expressing level Published year &author真菌Fungi2.3kb cDNA300bp r5μg/mL (total)Ward,et al.(1992)[20]alcA promote1.5μg/mL (secreted)(ELISA analysis)1)真菌Fungi2.1kb cDNA 1.1kb glucoamylase 2,000μg/mL (secreted)gene promoter (ELISA analysis)Ward,et al.(1995)[21]酵母Yeast Full length cDNA Yeast chelatin promoter 20~30μg/mL (total)Liang,et al.(1993)[22]1.5~2.0μg/mL (secreted)2)仓鼠肾脏细胞 2.3kb full length MT-1promoter20μg/mL (secreted)Stowell,et al.(1991)[23]Baby-hamster cDNA(Determined by the A280of the kidney cells pooled column fractions)烟草细胞Full length cDNA CaMV 35S promoter 0.6%~2.5%of the total Mitra,et al.(1994)[24]cellular protein烟草 2.1kb full length DP35ScaMV promoter(1)0.1%of total extracted Salmon,et al.(1998)[25]TobaccocDNAleaf proteins(2)0.3%of total extracted leaf proteins 3)(ELISA)马铃薯 2.3kb full length 1.Mas P2promoter (1)0.01%of total soluble protein Chong,et al.(2000)[26]Potato cDNA2.CaMV 35S promoter (2)0.1%of total soluble protein 4)(ELISA analysis)小鼠Mice Full length cDNA 7.7kb αs1-casein 0.1~36μg/mL Platenburg,et al.(1994)[27]promoter(RIA analysis)小鼠Mice Genomic sequence 6.2kb αs1-casein gene >1000μg/mLDe Wit,et al.(1993)promoter 小鼠Mice1.hLF cDNA αs1-casein gene 1400~1300μg/mL Nuijens,et al.(1997)[28]2.hLF genomic promoter2.300~3800μg/mL sequence(RIA analysis)6)小鼠Mice 2.5kb hLF cDNA 2kb bovine β-casein 1~200μg/mL 7)Kim,et al.(1994)[29,30]gene promoter (ELISA analysis)小鼠Mice 27kb genomic 10kb bovine β-casein 60~6600μg/mL 8)Kim,et al.(1999)[31]sequence gene promoter (ELISA analysis)小鼠Mice 147kb genomic 90kb hLF gene 400~7800μg/mL Liang,et al.(2003)[32]sequence promoter (RIA analysis)10)牛CattleGenomic 6.2kb αs1-casein 300~2800μg/mL 9)van Berkel,et al.(2002)[33]sequencegene promoter (ELISA analysis)472第4期赵春江等:人乳铁蛋白转基因研究进展最高可达6600μg/mL，而用cDNA得到的转基因小鼠的重组人乳铁蛋白的表达量不超过30μg/mL。