朊病毒

生命科学学院11级生物工程 C01114013 宋强微生物学

朊病毒综述

一、朊病毒的发现

早在300年前，人们已经注意到在绵羊和山羊身上患的“羊搔痒症”。其症状表现为：丧失协调性、站立不稳、烦躁不安、奇痒难熬，直至瘫痪死亡。20世纪60年代，英国生物学家阿尔卑斯用放射处理破坏DNA和RNA后，其组织仍具感染性，因而认为“羊搔痒症”的致病因子并非核酸，而可能是蛋白质。由于这种推断不符合当时的一般认识，也缺乏有力的实验支持，因而没有得到认同，甚至被视为异端邪说。1947年发现水貂脑软化病，其症状与“羊搔症症”相似。以后又陆续发现了马鹿和鹿的慢性消瘦病（萎缩病）、猫的海绵状脑病。最为震惊的当首推1996年春天“疯牛病”在英国以至于全世界引起的一场空前的恐慌，甚至引发了政治与经济的动荡，一时间人们“谈牛色变”。1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利·普鲁辛纳（Stanley B.P Prusiner），因为他发现了一种新型的生物——朊病毒（Piron）。“朊病毒”最早是由美国加州大学Prusiner等提出的，在此之前，它曾经有许多不同的名称，如非寻常病毒、慢病毒、传染性大脑样变等，多年来的大量实验研究表明，它是一组至今不能查到任何核酸，对各种理化作用具有很强抵抗力，传染性极强，分子量在2.7万～3万的蛋白质颗粒，它是能在人和动物中引起可传染性脑病（TSE）的一个特殊的病因。

二、朊病毒的概念

1982年stanly B1prusiner等提出蛋白质感染颗粒（pro teinaceous infectious particles，prion）假说，提出了朊病毒（prion）的概念，他给朊病毒所下的定义是：朊病毒是不被大多数修饰核酸的方法灭活的蛋白质传染性颗粒（proteinaceous infectious particle；缩写为prion，今的朊病毒假说是唯蛋白质说，认为朊病毒是一种蛋白质，不含核酸，分子量33kD~35kD，抗蛋白酶的PrPSc是其唯一（或主要）成分；它是宿主PrP基因编码的蛋白PrPC经翻译后修饰构象改变形成，在朊病毒病病理发生中起主导作用，其复制和分离物（或毒株）的不同特性都由其自身和宿主PrPC相互作用决定，而不依赖于任何核酸。

在病毒分类上，近年来已将其与卫星因子和类病毒一同纳入亚病毒因子（subviral agents），以与真病毒相区分。

朊病毒病是由一种新型蛋白感染因子引起的人和动物可转移神经退化性疾病，又称海绵状脑病，最终可导致患者死亡。此类疾病包括人的震颤病，克雅氏病（CJD），吉斯综合征（GSS）和致死性家族失眠症（FFI）以及动物的羊瘙痒病、牛海绵脑病（俗称疯牛病）和鹿、猫、水貂等的海绵状脑病，这些疾病的共同特征是使动物和人产生认知和运动功能的严重衰退直至死亡，其临床和病理特征表现为脑组织的海绵体化、空泡化、星形胶质细胞和小胶质细胞的形成以及致病蛋白的积累。

三、朊病毒的性质

位于细胞膜表面的正常朊蛋白，即细胞型朊蛋白（PrPc）是与糖基磷脂酰基醇（GPI）相连的一种糖蛋白。该蛋白的N段有2个糖基化位点，在细胞膜上大量存在。鼠、人、牛的成熟PrPc结构具有一些共性：具有一个长而弯曲的氨基末端，3个A螺旋，第1个A螺旋的侧面是一个双链反向平行的B折叠；其中第2个B折叠和第3个A螺旋间有一个大的环状结构。此环一般极度弯曲，但麋鹿及鹿的朊蛋白中该环却是径直的。此结构可能与鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病有关。

N段的末端存在2个保守区。第1个区域由5个八肽重复区组成，该功能区在与铜离子结合的过程中起重要作用，属于朊病发病机制的一部分；第2个功能区位于第1功能区的下游，为高度疏水及相对保守的区域，起初被命名为跨膜区，但从生理学角度考虑还不清楚跨膜区的真正功能，有人建议命名为疏水核心区。

四、朊病毒的检测

动物传递实验：动物传递实验是早期判断生物体是否感染朊病毒、测定感染滴度、研究朊病毒传染性的主要手段。随着检测技术的进步，现在动物实验的许多功能已被更快捷、更准确的方法所代替，但作为生物学方法仍然是研究朊病毒不可缺少的重要环节。目前，已知的朊病毒病大多已建立了动物感染模型，小鼠、大鼠和仓鼠是最常用的朊病毒实验动物。

免疫学方法：免疫学检测方法由于其灵敏度高，特异性强，方法众多，能适合不同检验要求的需要，目前已成为检测朊病毒的最主要方法。

组织印迹：组织印迹技术是将灵敏的蛋白检测技术和解剖学组织保存技术结合起来，用于检测组织中微量的PrPsc，其灵敏度较高，甚至可以超过一般的免疫印迹，已被广泛地用于朊病毒的研究。

斑点印迹：将组织标本置于冷的裂解缓冲液中匀浆，然后500 r/min离心5 min，去除不溶性残渣，上清液与含SDS样本缓冲液等量混合，吸取4L混合液，点样于干的NC膜上，空气中干燥，PK消化，3 mol/L硫氰酸胍处理，封闭后，进行免疫学检测。斑点印迹法灵敏度较低，但操作简便，对仪器设备要求低，适合大批量标本的筛查，易于普及推广。

免疫印迹：免疫印迹技术简便、快速，对仪器设备要求低，而且不受组织自溶的影响，能在组织病理学结果阴性或含糊的情况下检出PrPres，具有早期确诊价值。目前，已成为朊病毒研究中最常用的检测方法之一。其基本步骤是：将待检组织标本匀浆、离心、蛋白酶K消化等一系列处理后，在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后将蛋白质转印至NC膜或PVDF膜上，封闭，用特异性抗体进行免疫学检测。

免疫组化：利用特异性抗体直接显示组织切片上致病性PrP。免疫组化可以检测甲醛固定、石蜡包埋的组织标本，应用面较广。其基本步骤是：将甲醛固定或石蜡包埋的组织标本经一系列预处理后，依次与特异性抗体和酶标记第二抗体反应，最后加底物显色，显微镜下观察。

酶联免疫吸附实验（ELISA）：目前报道的用于检测朊病毒的ELISA方法有两种：一种是间接法，即先将从各个标本中提取的PrPres分别包被于酶标板的孔中；另一种是双抗体夹心法，即先用特异性抗体包被酶标板，再加入标本提取物，37℃孵育。此后两种方法都依次加入特异性1抗、酶标2抗，最后加底物显色，酶标仪读板。方法具有灵敏、特异、简便、快速、可定量、自动化等特点，非常适合大批量标本的普查筛选工作。

电镜法：基本步骤是：将被检组织置于10% N-laruoylsarcosine溶液中匀浆，差速离心、PK消化，重悬于蒸馏水中，负染，电镜观察。镜下可见两种瘙痒病特有的大分子纤维。电镜检查SAF灵敏度较低，不如免疫印迹方法。

毛细管SDS-凝胶电泳：该法主要是通过理化方法——差速、超速离心、sodium Nlauroylsarcosine、PK处理，提纯PrPsc，然后在Beckman P/ACE 5 500