第二章 酶的分离工程

2. 酶分离纯化的特点、基本环节有哪些？
3如何根据酶的性质选择分离纯化方法
4写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原 理。 5细胞破碎的目的、方法及原理。
6酶抽提的目标、方法及影响因素。
思考题



7. 酶液制备的过程有哪些？ 8. 说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。 9. 酶的结晶方法有哪些？ 10. 分析说明酶分离纯化的应用
（三）脱色 酶的工业生产中，常用的脱色剂为活 性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性 炭用量一般为0.1%-1.5%。
四、酶溶液的浓缩
冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在 真空状态下使水分子从固体表面直接升华。
蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发 法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄 的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽 液分离器达到浓缩的目的。
4、酶促破碎法（Enzymatic lysis）
• lysozyme、 protease、 cellulase、zymolyase • 价格高，通用性差，产物抑制的存在
• 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁， 使胞内酶释放。
二、酶的提取
大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用 稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽 提液的具体组成和抽提条件的选择取决于 酶的溶解性 、稳定性以及有利于切断酶与 其它物质的连结。

酶的分离纯化策略
一原则 二方法选择
三纯化策略
四纯见检定
应注意的问题：
一、防止酶的变性失活
1.低温操作 2.控制pH 3.减少泡沫形成 4.防重金属、有机溶剂、微生物污染
5．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
二、选择有效的纯化方法
三、酶活性测定贯穿纯化过程的始终。
酶分离纯化的一般步骤:
枯草杆菌碱性磷酸酶用Leabharlann .1mol/LMgCl2溶液提取。
2、酸溶液提取 例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取 3、碱溶液提取 例：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的碱溶 液提取。
pH值与酶的稳定性相关，选择pH不能超出酶的稳 定范围，从抽提效果而言pH值要偏离目的酶等电点， 也就是说酶如果是酸性蛋白质则宜用稀碱溶液来抽 提，反之碱性蛋白用酸来抽提。
1）压力差破碎法
高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）
2）温度差破碎法
反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐 浓度增高而引起细胞溶胀破碎.
3）超声波破碎法（Ultrasonication）
杆菌比球菌容易破碎
G-比 G+容易破碎
酵母菌不易破碎
3、化学破碎法
1）渗透作用：
将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖 和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅 拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来； 2）自溶： 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细 胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶； 3）表面活性剂： 膜结合的酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活 性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。
[教学目的] 了解酶的分离纯化方法；
掌握酶生产、研究的重要环节：酶的分离流程与各 单元操作的原理。
[重点与难点] 1、如何运用本章所学对蛋白质的酶学性质（如分子质 量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）进行研究。 2、如何耦合与集成酶分离工程的单元操作。 [课堂教学设计] 图示以讲清复杂的原理，生产科研实例与理论相结合。
[教学时数]
5学时

生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、 生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并 纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白 质等）的过程，又称为下游加工过程。
作业题



1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计 发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举 例说明。 2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋 白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总 个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化 的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什 么？ 3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、 凝胶过滤、亲和层析 在原理、操作(装柱、过柱） 及应用方面的异同点。
助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝
工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）
如：Dyno-mill球磨机
3）匀浆法（ homogenization ）
利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器的研 杵的磨球和玻璃管内壁之间间隙常保持在十分之几毫米 距离。破碎细胞的程度比组织捣碎机高。 大型细胞破碎器： Manton-Gaulin匀浆器主要是高压下 使细胞通过小孔隙而被挤碎，每小时可处理数十升至数 千升样品，适用于微生物发酵工业生产。 •对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法 •丝状真菌、较小的G+菌不宜用此法
层析法
电泳法
生物组织→ →提取液→ →粗产品→ 超离心法 透析和超滤 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ →结晶
依据原理
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、酶 解、化学处理） •有效成分的抽提 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用 丁醇提取，都取得良好效果。
影响酶提取的主要因素
1、温度 为防止变性失活,制备具有活性的酶, 提取温度一般不易过高，一般在 0℃~10℃的低温操作.
但如果抽提的酶比较稳定也可以用高温。 如胃蛋白酶可以在37℃抽提。
2、pH值 酶的溶解度和稳定性与pH值有关. 首先考虑酶的稳定性；其次应远离等 电点；一般选择pH4-6为宜。 提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内, 为了提高酶的溶解度，提取时pH值应 避开酶的等电点。
各种双水相系统
聚合物P
聚丙二醇
聚合物Q或盐
甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯 醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖
聚乙二醇（PEG） 聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖
甲基纤维素
乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
羧甲基葡聚糖、葡聚糖（Dex）
葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸 钠、酒石酸钾钠
Protein and Enzyme
Engineering 蛋白质与酶工程
E-mail:xsp6210@
第四章 酶的提取与分离纯化
酶的提取与分离纯化：将酶从细胞 或其他含酶原料中提取出来，再与 杂质分开而获得所要求的酶制品的 过程。
思考题
思考题： 1. 名词解释：酶的抽提、离子交换层析、凝胶层析、凝 胶电泳、酶的结晶
作业题
4.比较说明用于酶层析分离的层析介质 应该具有的共性和个性：它们是吸附层 析、分配层析、离子交换层析、凝胶层 析、亲和层析。 5. 用于表明酶纯度的是哪种电泳？用于 制备的是哪种电泳？原理？

作业题
6.等密度梯度离心、层析聚焦与等电聚焦电 泳有何异同？ 7.离子交换纤维素 为什么较离子交换树脂更 常用于酶等大分子物质的分离？
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
天冬氨酸酶 -半乳糖苷酶
菌
种
相系统
PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐
延胡索酸酶 Brevibacterium sp E. coli E. coli Baker’s yeast E.coli
亮氨酸脱氢酶 Bacillus sphaericus PEG/Dex 乙醇脱氢酶 青霉素酰化酶
液中沉淀成酶泥；
胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；
动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材
料应避免单宁等物质着色污染。
（二）细胞破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部 位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的 方法也不相同。 1、机械破碎法
2、物理破碎法 3、化学破碎法
4、酶促破碎法
1）捣碎法 利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破 碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽 等材料的破碎。 2）研磨法 利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪 切力将组织细胞破碎。
4、有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶 难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶 剂提取。 如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。 动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。
常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮 等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有 亲水性和亲脂性。
三、酶溶液的絮凝、净化与脱色
（一）絮凝 发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖 蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液 的离心或过滤带来困难。 通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过 滤将细胞碎片和杂蛋白、粘多糖、核酸以及脂 类等大分子物质去除。 无机（如醋酸钙和磷酸钙等），有机（如聚丙 烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）
（1）原理：利用溶质在两个互不相溶的水相中 的溶解度不同而达到分离。
双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之 间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相 或多水相系统 开始于20世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激 素、病毒等分离提纯。
双水相萃取技术

双水相萃取技术((Two-aqueous phase extraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶 液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离 物在两相中分配不同,便可实现分离
分离工程概念及步骤
分离与提纯 从生物反应器中排出的反应产物是一种混合物， 里面除含有目的产品外，还含有未转化的基质、不 能转化的物质、大量的水、微生物体及各种微量杂 质。为了获得合格的生化产品，并且不浪费其他有 用的物质，必须对需要的生化产品进行分离或提纯。 这一过程称之为“下游加工”，这样可以使其他物 质循环使用或再进行综合利用，既降低了成本又保 护了环境。