第二章 酶的分离工程
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层析法
电泳法
生物组织→ →提取液→ →粗产品→ 超离心法 透析和超滤 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ →结晶
依据原理
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、酶 解、化学处理） •有效成分的抽提 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
（1）原理：利用溶质在两个互不相溶的水相中 的溶解度不同而达到分离。
双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之 间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相 或多水相系统 开始于20世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激 素、病毒等分离提纯。
双水相萃取技术
双水相萃取技术((Two-aqueous phase extraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶 液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离 物在两相中分配不同,便可实现分离
（三）脱色 酶的工业生产中，常用的脱色剂为活 性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性 炭用量一般为0.1%-1.5%。
四、酶溶液的浓缩
冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在 真空状态下使水分子从固体表面直接升华。
蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发 法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄 的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽 液分离器达到浓缩的目的。
枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。
2、酸溶液提取 例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取 3、碱溶液提取 例：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的碱溶 液提取。
pH值与酶的稳定性相关，选择pH不能超出酶的稳 定范围，从抽提效果而言pH值要偏离目的酶等电点， 也就是说酶如果是酸性蛋白质则宜用稀碱溶液来抽 提，反之碱性蛋白用酸来抽提。
（二）过滤或离心净化
1、离心分离——从细胞抽提物中除掉固体 离心机的选择： 工业：连续流动离心机、间歇卸料的圆盘式 离心机
2、过滤——从细胞抽提物中除掉固体 涡流膜过滤法（ cross-flow membrane filtration ）
3、双水相萃取
适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯 化目的酶。
4、酶促破碎法（Enzymatic lysis）
• lysozyme、 protease、 cellulase、zymolyase • 价格高，通用性差，产物抑制的存在
• 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁， 使胞内酶释放。
二、酶的提取
大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用 稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽 提液的具体组成和抽提条件的选择取决于 酶的溶解性 、稳定性以及有利于切断酶与 其它物质的连结。
[教学目的] 了解酶的分离纯化方法；
掌握酶生产、研究的重要环节：酶的分离流程与各 单元操作的原理。
[重点与难点] 1、如何运用本章所学对蛋白质的酶学性质（如分子质 量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）进行研究。 2、如何耦合与集成酶分离工程的单元操作。 [课堂教学设计] 图示以讲清复杂的原理，生产科研实例与理论相结合。
（2）影响酶在两相中分配系数的因素 1）两相的组成 2）高分子聚合物的分子量、浓度、极性等 3）两相溶液的比例 4）酶的分子量、电荷、极性等 5）温度、pH值等
（3）双水相萃取 技术的优点
双水相体系为酶的溶解和抽提提供了适 宜环境，而且处理容量大。 设备简单。 操作方便、快速、条件温和。 不需处理就可与后续提纯步骤相衔接。
第一节 酶溶液的制备（前处理）
把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液。 酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、 抽提、净化脱色、抽提液的浓缩等几个步骤。
一、材料预处理及细胞破碎
（一）材料预处理
酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内 酶（游离酶和膜结合酶）。
微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵
[教学时数]
5学时
生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、 生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并 纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白 质等）的过程，又称为下游加工过程。
作业题
1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计 发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举 例说明。 2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋 白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总 个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化 的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什 么？ 3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、 凝胶过滤、亲和层析 在原理、操作(装柱、过柱） 及应用方面的异同点。
4、有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶 难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶 剂提取。 如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。 动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。
常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮 等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有 亲水性和亲脂性。
2. 酶分离纯化的特点、基本环节有哪些？
3如何根据酶的性质选择分离纯化方法
4写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原 理。 5细胞破碎的目的、方法及原理。
6酶抽提的目标、方法及影响因素。
思考题
7. 酶液制备的过程有哪些？ 8. 说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。 9. 酶的结晶方法有哪些？ 10. 分析说明酶分离纯化的应用
作业题
4.比较说明用于酶层析分离的层析介质 应该具有的共性和个性：它们是吸附层 析、分配层析、离子交换层析、凝胶层 析、亲和层析。 5. 用于表明酶纯度的是哪种电泳？用于 制备的是哪种电泳？原理？
作业题
6.等密度梯度离心、层析聚焦与等电聚焦电 泳有何异同？ 7.离子交换纤维素 为什么较离子交换树脂更 常用于酶等大分子物质的分离？
液中沉淀成酶泥；
胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；
动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材
料应避免单宁等物质着色污染。
（二）细胞破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部 位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的 方法也不相同。 1、机械破碎法
2、物理破碎法 3、化学破碎法
4、酶促破碎法
1）捣碎法 利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破 碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽 等材料的破碎。 2）研磨法 利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪 切力将组织细胞破碎。
（一）酶提取的方法
（二）影响酶提取的主要因素
1、盐溶液提取
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，浓度一般控 制在0.02~0.5mol/L。
常采用等渗溶液，即0.125mol/L NaCl和 0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸缓冲液或 0.1mol/L Tris-HCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA （1~5mmol/L）、巯基乙醇（3~20mmol/L）等。 例：酵母醇脱氢酶用0.5mol/L Na2HPO4溶液提取。 6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取。
各种双水相系统
聚合物P
聚丙二醇
聚合物Q或盐
甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯 醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖
聚乙二醇（PEG） 聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖
甲基纤维素
乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
羧甲基葡聚糖、葡聚糖（Dex）
葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸 钠、酒石酸钾钠
超过滤法：将酶溶液通过只允许小分子物质通过 的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩 的目的。 胶过滤法：利用Sephadex G-250或G-50吸水膨 胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。
其它方法： 吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。 干燥：将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他 溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过 程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气 流干燥、吸附干燥
1）压力差破碎法
高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）
2）温度差破碎法
反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐 浓度增高而引起细胞溶胀破碎.
3）超声波破碎法（Ultrasonication）
源自文库杆菌比球菌容易破碎
G-比 G+容易破碎
酵母菌不易破碎
3、化学破碎法
1）渗透作用：
将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖 和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅 拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来； 2）自溶： 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细 胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶； 3）表面活性剂： 膜结合的酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活 性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。
三、酶溶液的絮凝、净化与脱色
（一）絮凝 发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖 蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液 的离心或过滤带来困难。 通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过 滤将细胞碎片和杂蛋白、粘多糖、核酸以及脂 类等大分子物质去除。 无机（如醋酸钙和磷酸钙等），有机（如聚丙 烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）
助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝
工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）
如：Dyno-mill球磨机
3）匀浆法（ homogenization ）
利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器的研 杵的磨球和玻璃管内壁之间间隙常保持在十分之几毫米 距离。破碎细胞的程度比组织捣碎机高。 大型细胞破碎器： Manton-Gaulin匀浆器主要是高压下 使细胞通过小孔隙而被挤碎，每小时可处理数十升至数 千升样品，适用于微生物发酵工业生产。 •对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法 •丝状真菌、较小的G+菌不宜用此法
酶的分离纯化策略
一原则 二方法选择
三纯化策略
四纯见检定
应注意的问题：
一、防止酶的变性失活
1.低温操作 2.控制pH 3.减少泡沫形成 4.防重金属、有机溶剂、微生物污染
5．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
二、选择有效的纯化方法
三、酶活性测定贯穿纯化过程的始终。
酶分离纯化的一般步骤:
例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用 丁醇提取，都取得良好效果。
影响酶提取的主要因素
1、温度 为防止变性失活,制备具有活性的酶, 提取温度一般不易过高，一般在 0℃~10℃的低温操作.
但如果抽提的酶比较稳定也可以用高温。 如胃蛋白酶可以在37℃抽提。
2、pH值 酶的溶解度和稳定性与pH值有关. 首先考虑酶的稳定性；其次应远离等 电点；一般选择pH4-6为宜。 提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内, 为了提高酶的溶解度，提取时pH值应 避开酶的等电点。
3、提取液的体积 一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提 取。
4、辅助因子：在提取操作时适当加入底物或 辅酶成分，可以改变提高酶的稳定性。为了防 止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺 酰氟）；为防止氧化，则加入半胱氨酸或巯基 乙醇。
5、其他
含酶原料颗粒大小、搅拌、提取时间。 搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和 搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大 了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性 失活.因为
Protein and Enzyme
Engineering 蛋白质与酶工程
E-mail:xsp6210@163.com
第四章 酶的提取与分离纯化
酶的提取与分离纯化：将酶从细胞 或其他含酶原料中提取出来，再与 杂质分开而获得所要求的酶制品的 过程。
思考题
思考题： 1. 名词解释：酶的抽提、离子交换层析、凝胶层析、凝 胶电泳、酶的结晶
分离工程概念及步骤
分离与提纯 从生物反应器中排出的反应产物是一种混合物， 里面除含有目的产品外，还含有未转化的基质、不 能转化的物质、大量的水、微生物体及各种微量杂 质。为了获得合格的生化产品，并且不浪费其他有 用的物质，必须对需要的生化产品进行分离或提纯。 这一过程称之为“下游加工”，这样可以使其他物 质循环使用或再进行综合利用，既降低了成本又保 护了环境。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
天冬氨酸酶 -半乳糖苷酶
菌
种
相系统
PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐
延胡索酸酶 Brevibacterium sp E. coli E. coli Baker’s yeast E.coli
亮氨酸脱氢酶 Bacillus sphaericus PEG/Dex 乙醇脱氢酶 青霉素酰化酶
电泳法
生物组织→ →提取液→ →粗产品→ 超离心法 透析和超滤 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ →结晶
依据原理
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、酶 解、化学处理） •有效成分的抽提 •盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •离心
•分子大小 •溶解度 •电荷性质 •吸附性质 •生物亲和力
（1）原理：利用溶质在两个互不相溶的水相中 的溶解度不同而达到分离。
双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之 间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相 或多水相系统 开始于20世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激 素、病毒等分离提纯。
双水相萃取技术
双水相萃取技术((Two-aqueous phase extraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶 液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离 物在两相中分配不同,便可实现分离
（三）脱色 酶的工业生产中，常用的脱色剂为活 性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性 炭用量一般为0.1%-1.5%。
四、酶溶液的浓缩
冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在 真空状态下使水分子从固体表面直接升华。
蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发 法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄 的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽 液分离器达到浓缩的目的。
枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。
2、酸溶液提取 例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取 3、碱溶液提取 例：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的碱溶 液提取。
pH值与酶的稳定性相关，选择pH不能超出酶的稳 定范围，从抽提效果而言pH值要偏离目的酶等电点， 也就是说酶如果是酸性蛋白质则宜用稀碱溶液来抽 提，反之碱性蛋白用酸来抽提。
（二）过滤或离心净化
1、离心分离——从细胞抽提物中除掉固体 离心机的选择： 工业：连续流动离心机、间歇卸料的圆盘式 离心机
2、过滤——从细胞抽提物中除掉固体 涡流膜过滤法（ cross-flow membrane filtration ）
3、双水相萃取
适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯 化目的酶。
4、酶促破碎法（Enzymatic lysis）
• lysozyme、 protease、 cellulase、zymolyase • 价格高，通用性差，产物抑制的存在
• 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁， 使胞内酶释放。
二、酶的提取
大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用 稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽 提液的具体组成和抽提条件的选择取决于 酶的溶解性 、稳定性以及有利于切断酶与 其它物质的连结。
[教学目的] 了解酶的分离纯化方法；
掌握酶生产、研究的重要环节：酶的分离流程与各 单元操作的原理。
[重点与难点] 1、如何运用本章所学对蛋白质的酶学性质（如分子质 量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）进行研究。 2、如何耦合与集成酶分离工程的单元操作。 [课堂教学设计] 图示以讲清复杂的原理，生产科研实例与理论相结合。
（2）影响酶在两相中分配系数的因素 1）两相的组成 2）高分子聚合物的分子量、浓度、极性等 3）两相溶液的比例 4）酶的分子量、电荷、极性等 5）温度、pH值等
（3）双水相萃取 技术的优点
双水相体系为酶的溶解和抽提提供了适 宜环境，而且处理容量大。 设备简单。 操作方便、快速、条件温和。 不需处理就可与后续提纯步骤相衔接。
第一节 酶溶液的制备（前处理）
把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液。 酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、 抽提、净化脱色、抽提液的浓缩等几个步骤。
一、材料预处理及细胞破碎
（一）材料预处理
酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内 酶（游离酶和膜结合酶）。
微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵
[教学时数]
5学时
生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、 生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并 纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白 质等）的过程，又称为下游加工过程。
作业题
1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计 发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举 例说明。 2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋 白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总 个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化 的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什 么？ 3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、 凝胶过滤、亲和层析 在原理、操作(装柱、过柱） 及应用方面的异同点。
4、有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶 难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶 剂提取。 如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。 动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。
常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮 等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有 亲水性和亲脂性。
2. 酶分离纯化的特点、基本环节有哪些？
3如何根据酶的性质选择分离纯化方法
4写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原 理。 5细胞破碎的目的、方法及原理。
6酶抽提的目标、方法及影响因素。
思考题
7. 酶液制备的过程有哪些？ 8. 说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。 9. 酶的结晶方法有哪些？ 10. 分析说明酶分离纯化的应用
作业题
4.比较说明用于酶层析分离的层析介质 应该具有的共性和个性：它们是吸附层 析、分配层析、离子交换层析、凝胶层 析、亲和层析。 5. 用于表明酶纯度的是哪种电泳？用于 制备的是哪种电泳？原理？
作业题
6.等密度梯度离心、层析聚焦与等电聚焦电 泳有何异同？ 7.离子交换纤维素 为什么较离子交换树脂更 常用于酶等大分子物质的分离？
液中沉淀成酶泥；
胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；
动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材
料应避免单宁等物质着色污染。
（二）细胞破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部 位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的 方法也不相同。 1、机械破碎法
2、物理破碎法 3、化学破碎法
4、酶促破碎法
1）捣碎法 利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破 碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽 等材料的破碎。 2）研磨法 利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪 切力将组织细胞破碎。
（一）酶提取的方法
（二）影响酶提取的主要因素
1、盐溶液提取
一般采用稀盐溶液进行酶的提取，浓度一般控 制在0.02~0.5mol/L。
常采用等渗溶液，即0.125mol/L NaCl和 0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸缓冲液或 0.1mol/L Tris-HCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA （1~5mmol/L）、巯基乙醇（3~20mmol/L）等。 例：酵母醇脱氢酶用0.5mol/L Na2HPO4溶液提取。 6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取。
各种双水相系统
聚合物P
聚丙二醇
聚合物Q或盐
甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯 醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖
聚乙二醇（PEG） 聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖
甲基纤维素
乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
羧甲基葡聚糖、葡聚糖（Dex）
葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸 钠、酒石酸钾钠
超过滤法：将酶溶液通过只允许小分子物质通过 的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩 的目的。 胶过滤法：利用Sephadex G-250或G-50吸水膨 胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。
其它方法： 吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。 干燥：将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他 溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过 程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气 流干燥、吸附干燥
1）压力差破碎法
高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）
2）温度差破碎法
反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐 浓度增高而引起细胞溶胀破碎.
3）超声波破碎法（Ultrasonication）
源自文库杆菌比球菌容易破碎
G-比 G+容易破碎
酵母菌不易破碎
3、化学破碎法
1）渗透作用：
将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖 和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅 拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来； 2）自溶： 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细 胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶； 3）表面活性剂： 膜结合的酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活 性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。
三、酶溶液的絮凝、净化与脱色
（一）絮凝 发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖 蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液 的离心或过滤带来困难。 通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过 滤将细胞碎片和杂蛋白、粘多糖、核酸以及脂 类等大分子物质去除。 无机（如醋酸钙和磷酸钙等），有机（如聚丙 烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）
助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝
工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）
如：Dyno-mill球磨机
3）匀浆法（ homogenization ）
利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器的研 杵的磨球和玻璃管内壁之间间隙常保持在十分之几毫米 距离。破碎细胞的程度比组织捣碎机高。 大型细胞破碎器： Manton-Gaulin匀浆器主要是高压下 使细胞通过小孔隙而被挤碎，每小时可处理数十升至数 千升样品，适用于微生物发酵工业生产。 •对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法 •丝状真菌、较小的G+菌不宜用此法
酶的分离纯化策略
一原则 二方法选择
三纯化策略
四纯见检定
应注意的问题：
一、防止酶的变性失活
1.低温操作 2.控制pH 3.减少泡沫形成 4.防重金属、有机溶剂、微生物污染
5．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基
二、选择有效的纯化方法
三、酶活性测定贯穿纯化过程的始终。
酶分离纯化的一般步骤:
例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用 丁醇提取，都取得良好效果。
影响酶提取的主要因素
1、温度 为防止变性失活,制备具有活性的酶, 提取温度一般不易过高，一般在 0℃~10℃的低温操作.
但如果抽提的酶比较稳定也可以用高温。 如胃蛋白酶可以在37℃抽提。
2、pH值 酶的溶解度和稳定性与pH值有关. 首先考虑酶的稳定性；其次应远离等 电点；一般选择pH4-6为宜。 提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内, 为了提高酶的溶解度，提取时pH值应 避开酶的等电点。
3、提取液的体积 一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提 取。
4、辅助因子：在提取操作时适当加入底物或 辅酶成分，可以改变提高酶的稳定性。为了防 止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺 酰氟）；为防止氧化，则加入半胱氨酸或巯基 乙醇。
5、其他
含酶原料颗粒大小、搅拌、提取时间。 搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和 搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大 了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性 失活.因为
Protein and Enzyme
Engineering 蛋白质与酶工程
E-mail:xsp6210@163.com
第四章 酶的提取与分离纯化
酶的提取与分离纯化：将酶从细胞 或其他含酶原料中提取出来，再与 杂质分开而获得所要求的酶制品的 过程。
思考题
思考题： 1. 名词解释：酶的抽提、离子交换层析、凝胶层析、凝 胶电泳、酶的结晶
分离工程概念及步骤
分离与提纯 从生物反应器中排出的反应产物是一种混合物， 里面除含有目的产品外，还含有未转化的基质、不 能转化的物质、大量的水、微生物体及各种微量杂 质。为了获得合格的生化产品，并且不浪费其他有 用的物质，必须对需要的生化产品进行分离或提纯。 这一过程称之为“下游加工”，这样可以使其他物 质循环使用或再进行综合利用，既降低了成本又保 护了环境。
几种典型的双水相萃取酶蛋白实例
酶
天冬氨酸酶 -半乳糖苷酶
菌
种
相系统
PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐 PEG/ 盐
延胡索酸酶 Brevibacterium sp E. coli E. coli Baker’s yeast E.coli
亮氨酸脱氢酶 Bacillus sphaericus PEG/Dex 乙醇脱氢酶 青霉素酰化酶