一株鲤春病毒血症病毒的初步分离及鉴定_安伟
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病毒液用不含血清的 M199 培养基以 100 ～ 10 － 9 梯度稀释，分别接种于形成汇合单层的 EPC 细胞的 96 孔微量细胞培养板中，每个稀释度设 8 个复孔，每孔 100 μL，使细胞量达到 2 × 105 ～ 3 × 105 个·mL － 1 ，同时设未接种病毒液的对照组。吸 附完毕后，弃去病毒液，洗涤 2 次，每孔添加 2 % FBS 的 M199 细 胞 维 持 液，于 25 ℃ 的 条 件 下 培 养。逐日观察，记录结果，按 Ｒeed － Muench 法计 算病毒滴度。 1． 5 分子 PCＲ 鉴定 1． 5． 1 引物设计与合成
按照 ＲNAiso 说明书的步骤对病样组织进行 总 ＲNA 的提取，然后按照 Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 产 品 以 总 ＲNA 为 模 板 合 成 cDNA。加 入 Ｒadom 6 mers 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，提取的模板总 ＲNA 5 μL，
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水产科技情报 2014，41（ 1）
疡的诊治有极好的效果。 3． 2 其他甲壳溃疡的有效诊治方案
对患甲壳溃疡伴有并发症的宠物龟［10］，要从 多方面进行观察和诊治，不能只关注一个方面而 忽略其他方面。在诊治过程中要注意并发症的处 理，对眼炎、肺炎等要注意日常护理，对于病情比 较严重的像肺炎、肿瘤等，先通过葡萄糖和维生素 C、阿莫西林等药物灌胃处理，增强病 龟 的 抵 抗 力。治疗过程中，每天用白粉、双氧水等常规消毒 剂进行处理，再用庆大霉素、青霉素、头孢拉定等 药物治疗。应注意药物的使用剂量，以取得理想 的治疗效果。笔者在宠物龟甲壳溃疡诊治实践 中，上述宠物龟疾病的治愈率可达 80 % 以上。而 在养殖过程中早发现、早诊断、早治疗对提高甲壳 溃疡的治愈率十分重要。
水产科技情报 2014，41（ 1）
33
1． 3． 2 病毒分离 参照 Freshney 的方法进行细胞传代［4］。待
细胞基本形成汇合单层后，去掉细胞培养液，加入 病毒液吸附 1 ～ 2 h 后，弃去病毒液，加入 2 % FBS 的 M199 细胞维持液，同时以未接种病毒液的正 常细胞作对照，25 ℃ 恒温培养。每日在倒置显微 镜下观察细胞的形态变化情况。待接毒细胞病变 达到 80 % 时，可收集细胞病毒液，－ 80 ℃ 反复冻 融 3 次，于 4 ℃ 条件下 4 000 r·min － 1 离心 20 min， 收集病毒液上清分装于冻存管中，－ 80 ℃ 保存备 用。若接毒细胞 7 d 后仍无病理变化，则按正常 细胞的传代方法，盲传一次后，每日在倒置显微镜 下观察细胞的形态变化情况。病毒扩增培养时， 按照上述方法将冻存的病毒液上清接种细胞进行 病毒的扩增。 1． 4 病毒滴度的测定
反应体系 25 μL： cDNA 2 μL，10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，dNTP Mixture（ 各 2． 5 mM） 2 μL，上下游 引物各 0． 5 μL，TaKaＲa Taq（ 5 U·μL － 1 ） 0． 25 μL， dd H2 O 17． 25 μL。另设无模板对照组。2 对引 物扩增不同的目的片段。反应条件： 95 ℃ 4 min； 95 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共 30 个循环； 72 ℃ 10 min。产物经 2 % 琼脂糖电泳检测。
部分片段的 2 对特异性引物进行 PCＲ 扩增，结果
在 500 bp 和 750 bp 之间有 2 条不同的条带，与预
期目的片段大小相一致（ 见图 2） 。
图 2 PCＲ 产物鉴定结果
3 讨论
鲤春病毒血症是一种急性出血性传染性病毒 病，其宿主范围很广，能感染四大家鱼和其他几种 鲤科鱼类，其中鲤是最主要最易感的宿主。该病 的流行和发生对我国的水产养殖业，特别是鲤科 鱼类的养殖构成极大的威胁。该病毒最早由 Fijian 等［5］分离出来。2003 年中国内地首次报道分
2 结果
2． 1 细胞培养实验 首次将组织均 浆 过 滤 液 接 种 EPC 细 胞 7 d
后，细胞无明显变化，细胞培养液上清中死亡细胞 较正常细胞对照组多，盲传一次后，2 d 后细胞收 缩变圆，脱落，5 d 后，细胞单层大量脱落，呈破鱼 网状，出现典型病灶。而正常的 EPC 细胞形态均 一，轮廓清晰，细胞单层稳定。
于 2013 年在上海地区对 SVCV 的监测样品中，采 用细胞分离和 PCＲ 方法初步分离到一株 SVCV， 为 SVCV 的监测和鉴定提供了有力的技术支撑。
1 材料和方法
1． 1 细胞株 鲤鱼上皮瘤细胞（ EPC） 由农业部渔业动植物
病原库（ 上海海洋大学） 提供。 1． 2 试剂和耗材
M199 培养基、胎牛血清、胰酶为 Hyclone 公 司产品； PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转 录 试 剂 盒、Taq DNA 聚 合 酶、dNTPs、DNA Marker、ＲNAiso 购自 TAKAＲA 公司。 1． 3 细胞培养法分离病毒 1． 3． 1 病样处理
分子 PCＲ 方法检测方法参照《水生动物疾病 诊断手册》的设计，选用 SVCV 的糖蛋白基因作为 模板，设计 2 对引物： SVC － F1（ 5＇ － TCTTGGAGCCAAATAGCTCAＲＲTC － 3 ＇） 和 SVC － Ｒ2 （ 5 ＇ － AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY － 3 ＇） 扩 增该基因中的 714 bp 片段，而 SVC － F1 和 SVC － Ｒ4（ 5 ＇ － CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY － 3 ＇） 则从该片段中再扩增 606 bp 片段。 1． 5． 2 病毒 ＲNA 的提取与 cDNA 的合成
在 EPC 细 胞 中 稳 定 增 殖 后，其 病 毒 滴 度 TCID50 /0． 1 mL 为 105． 76 ，表明此株病毒有明显的 毒力。SVCV 有囊膜，且囊膜来自宿主细胞，易产 生非特异性抗体。制备高效价的抗血清比较困 难，所以免疫学方法的应用受到了限制［7 － 8］。随 着分子生物学技术的日益发展，PCＲ 技术为病原 检测提供了一种新的检测手段［9 － 10］。笔者参照 行业标准的检测方法，结合本实验室的仪器设备 及试剂要求，简化操作步骤，优化反应条件，建立 了适合于本实验室的一种简捷高效的检测方法。
离出 SVCV，但至今尚未发现治疗该病的有效药 物。目前国际上控制该病比较有效的措施是进行 监测，及早发现并进行隔离或扑杀，达到控制该病 暴发流行的目的。
现阶段，用于检测 SVCV 的方法主要有细胞 培养法、免疫学方法和分子生物学方法［6］。细胞 培养法在病毒学领域研究广泛，不仅作为病毒性 病原分离的经典方法，而且还可研究病毒的感染 机制以及抗病毒物质对病毒的作用方式和机理。 该方法是检验病毒病的传统方法，具有很高的准 确性，不易误诊。当某些毒力高、裂解性强的病毒 感染细胞时，细胞会出现损坏的组织学特征。本 研究中样品的组织匀浆液经过滤器过滤，可以去 除寄生虫和细菌，避免了其他因素对实验结果的 干扰，过滤液接种细胞 7 d 后，细胞仍没有发生变 化，但是经过盲传一代时，细胞出现皱缩、变圆、死 亡的现象。再次用病变细胞冻存液作为病原接种 细胞时，细胞出现同样的病变现象。这一结果可 证明检测样品中含有病毒性病原。
（ 下转第 38 页）
表 1 病毒的滴度测定结果
病毒稀释度
100 10 － 1 10 － 2 10 － 3 10 － 4 10 － 5 10 － 6 10 － 7 10 － 8 10 － 9
细胞孔数
8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
病变孔数
8 8 8 7 7 7 2 2 1 1
无病变孔数
0 0 0 1 1 1 6 6 7 7
计算公式：
l g TCID50 = 高于 50 % CPE 的稀释度对数 +
距离比例 × 稀释系数的对数
（ 1）
距离比例 = （ 高于 50 % CPE 率 － 50） / （ 高于
ຫໍສະໝຸດ Baidu
50 % CPE 率 － 低于 50 % CPE 率）
（ 2）
2． 3 分子 PCＲ 方法的鉴定结果
病样组织分别采用针对 SVCV 糖蛋白基因的
32 doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1994． 2014． 01． 008
水产科技情报 2014，41（ 1）
一株鲤春病毒血症病毒的初步分离及鉴定
安伟 肖雨 张崇文 张明辉 何正侃 ( 上海市水产研究所、上海市水生动物疫病预防控制中心( 筹) ，上海 200433)
累计总数
病变数 51 43 35 27 20 13 6 4 2 1
无病变数 0 0 0 1 2 3 9 15 22 29
病变比
51 /51 43 /43 35 /35 27 /28 20 /22 13 /16 6 /15 4 /19 2 /24 1 /30
病变率 /%
100 100 100 96． 4 90． 9 81． 25 40 21． 6 8． 3 3． 3
鲤 春 病 毒 血 症 病 毒 （ Spring Viremia of Carp Virus，简称 SVCV） 是一种弹状病毒，它可以引起 鲤科鱼类大规模暴发鲤春病毒血症（ SVC） ，该病 广泛流行于欧洲的鲤鱼养殖［1］。同 其他鱼类弹 状病毒一样，SVCV 感染是致死性的，临床表现为 水肿和出 血 症 状。 当 感 染 鱼 发 病 时，其 肾 脏，脾 脏，鳃和脑中含有大量的病毒［2］。SVC 为世界动 物卫生组织（ OIE） 规定的必须呈报的疫病之一， 中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动 物一、二类传染病、寄生虫病名录》（ 2008） 中的一 类动物疫病。由于 SVC 潜伏期短，外部症状不明 显、不典型，容易误诊而造成重大损失，所以要加 强 SVC 的预防措施，即建立快速准确的检测方法 监测该疾病的流行情况。病毒检测技术主要是采 用细胞培养的方法分离病毒，然后利用免疫学方 法，如中和试验、免疫荧光、免疫过氧化酶或酶联 免疫吸附（ ELISA） 等技术进行鉴定。随着现代生 物技术的快速发展，分子生物学方法检测技术在 病原检测领域广泛应用，PCＲ 方法通过检测核苷 酸可以快速准确地鉴定病原，灵敏度高［3］。笔者
（ A． 正常 EPC 细胞； B． 疑似 SVCV 病样感染的 EPC 细胞）
图 1 SVCV 感染 EPC 细胞的病变效应 （ 10 × 10 倍镜下观察）
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水产科技情报 2014，41（ 1）
2． 2 病毒滴度的测定
SVCV 能在 EPC 细胞中稳定地增殖，其病毒 滴度 TCID50 /0． 1 mL = 105． 76 （ 见表 1） 。
取病样的肾脏和脾脏，加入 10 倍的 PBS，用 组织匀浆器充分研磨，匀浆液在 － 80 ℃ 反复冻融 3 次，然后按 5 000 r·min － 1 离心 20 min，将上清液 经 0． 22 μm 滤膜过滤除菌，得病毒液，于 － 80 ℃ 保存备用。
收稿日期： 2013 － 08 － 20 作者简介： 安伟（ 1984—） ，男，助理工程师，主要从事鱼类病害防治技术研究。 通讯作者： 肖雨（ 1960—） ，女，高级工程师，主要从事水产养殖病害防治技术研究。
摘 要： 为了检测上海市某鲤鱼养殖场的疑似患病鲤鱼是否携带鲤春病毒血症病毒（ SVCV） ，采用鲤鱼表 皮瘤细胞系（ EPC） 进行病毒分离和分子 PCＲ 方法对 SVCV 的糖蛋白基因保守区域进行扩增。试验结果： 被病毒感染的 EPC 细胞呈现细胞圆缩、颗粒增多、大量脱落等病变特征，且该株病毒毒力较强，其病毒滴 度 TCID50 /0． 1 mL 为 105． 76 。分子方法扩增出 714 bp 和 606 bp 的 SVCV 的保守片段。试验采用细胞培养 技术和分子 PCＲ 方法检测样品是否携带病毒性病原，建立了一种较为简捷高效的检测方法。该方法适合 在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫任务，具有良好的应用前景。 关键词： 鲤春病毒血症病毒（ SVCV） ； 细胞分离； PCＲ 检测； 鲤
dd H2 O 3 μL，于 65 ℃ ，5 min 后冰上急冷，再加入 Buffer 4 μL，ＲNase 0． 5 μL，ＲTase 1 μL，dd H2 O 4． 5 μL，于 30 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min 进行逆转录反应。 1． 5． 3 PCＲ 方法的鉴定
按照 ＲNAiso 说明书的步骤对病样组织进行 总 ＲNA 的提取，然后按照 Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 产 品 以 总 ＲNA 为 模 板 合 成 cDNA。加 入 Ｒadom 6 mers 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，提取的模板总 ＲNA 5 μL，
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水产科技情报 2014，41（ 1）
疡的诊治有极好的效果。 3． 2 其他甲壳溃疡的有效诊治方案
对患甲壳溃疡伴有并发症的宠物龟［10］，要从 多方面进行观察和诊治，不能只关注一个方面而 忽略其他方面。在诊治过程中要注意并发症的处 理，对眼炎、肺炎等要注意日常护理，对于病情比 较严重的像肺炎、肿瘤等，先通过葡萄糖和维生素 C、阿莫西林等药物灌胃处理，增强病 龟 的 抵 抗 力。治疗过程中，每天用白粉、双氧水等常规消毒 剂进行处理，再用庆大霉素、青霉素、头孢拉定等 药物治疗。应注意药物的使用剂量，以取得理想 的治疗效果。笔者在宠物龟甲壳溃疡诊治实践 中，上述宠物龟疾病的治愈率可达 80 % 以上。而 在养殖过程中早发现、早诊断、早治疗对提高甲壳 溃疡的治愈率十分重要。
水产科技情报 2014，41（ 1）
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1． 3． 2 病毒分离 参照 Freshney 的方法进行细胞传代［4］。待
细胞基本形成汇合单层后，去掉细胞培养液，加入 病毒液吸附 1 ～ 2 h 后，弃去病毒液，加入 2 % FBS 的 M199 细胞维持液，同时以未接种病毒液的正 常细胞作对照，25 ℃ 恒温培养。每日在倒置显微 镜下观察细胞的形态变化情况。待接毒细胞病变 达到 80 % 时，可收集细胞病毒液，－ 80 ℃ 反复冻 融 3 次，于 4 ℃ 条件下 4 000 r·min － 1 离心 20 min， 收集病毒液上清分装于冻存管中，－ 80 ℃ 保存备 用。若接毒细胞 7 d 后仍无病理变化，则按正常 细胞的传代方法，盲传一次后，每日在倒置显微镜 下观察细胞的形态变化情况。病毒扩增培养时， 按照上述方法将冻存的病毒液上清接种细胞进行 病毒的扩增。 1． 4 病毒滴度的测定
反应体系 25 μL： cDNA 2 μL，10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，dNTP Mixture（ 各 2． 5 mM） 2 μL，上下游 引物各 0． 5 μL，TaKaＲa Taq（ 5 U·μL － 1 ） 0． 25 μL， dd H2 O 17． 25 μL。另设无模板对照组。2 对引 物扩增不同的目的片段。反应条件： 95 ℃ 4 min； 95 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共 30 个循环； 72 ℃ 10 min。产物经 2 % 琼脂糖电泳检测。
部分片段的 2 对特异性引物进行 PCＲ 扩增，结果
在 500 bp 和 750 bp 之间有 2 条不同的条带，与预
期目的片段大小相一致（ 见图 2） 。
图 2 PCＲ 产物鉴定结果
3 讨论
鲤春病毒血症是一种急性出血性传染性病毒 病，其宿主范围很广，能感染四大家鱼和其他几种 鲤科鱼类，其中鲤是最主要最易感的宿主。该病 的流行和发生对我国的水产养殖业，特别是鲤科 鱼类的养殖构成极大的威胁。该病毒最早由 Fijian 等［5］分离出来。2003 年中国内地首次报道分
2 结果
2． 1 细胞培养实验 首次将组织均 浆 过 滤 液 接 种 EPC 细 胞 7 d
后，细胞无明显变化，细胞培养液上清中死亡细胞 较正常细胞对照组多，盲传一次后，2 d 后细胞收 缩变圆，脱落，5 d 后，细胞单层大量脱落，呈破鱼 网状，出现典型病灶。而正常的 EPC 细胞形态均 一，轮廓清晰，细胞单层稳定。
于 2013 年在上海地区对 SVCV 的监测样品中，采 用细胞分离和 PCＲ 方法初步分离到一株 SVCV， 为 SVCV 的监测和鉴定提供了有力的技术支撑。
1 材料和方法
1． 1 细胞株 鲤鱼上皮瘤细胞（ EPC） 由农业部渔业动植物
病原库（ 上海海洋大学） 提供。 1． 2 试剂和耗材
M199 培养基、胎牛血清、胰酶为 Hyclone 公 司产品； PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转 录 试 剂 盒、Taq DNA 聚 合 酶、dNTPs、DNA Marker、ＲNAiso 购自 TAKAＲA 公司。 1． 3 细胞培养法分离病毒 1． 3． 1 病样处理
分子 PCＲ 方法检测方法参照《水生动物疾病 诊断手册》的设计，选用 SVCV 的糖蛋白基因作为 模板，设计 2 对引物： SVC － F1（ 5＇ － TCTTGGAGCCAAATAGCTCAＲＲTC － 3 ＇） 和 SVC － Ｒ2 （ 5 ＇ － AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY － 3 ＇） 扩 增该基因中的 714 bp 片段，而 SVC － F1 和 SVC － Ｒ4（ 5 ＇ － CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY － 3 ＇） 则从该片段中再扩增 606 bp 片段。 1． 5． 2 病毒 ＲNA 的提取与 cDNA 的合成
在 EPC 细 胞 中 稳 定 增 殖 后，其 病 毒 滴 度 TCID50 /0． 1 mL 为 105． 76 ，表明此株病毒有明显的 毒力。SVCV 有囊膜，且囊膜来自宿主细胞，易产 生非特异性抗体。制备高效价的抗血清比较困 难，所以免疫学方法的应用受到了限制［7 － 8］。随 着分子生物学技术的日益发展，PCＲ 技术为病原 检测提供了一种新的检测手段［9 － 10］。笔者参照 行业标准的检测方法，结合本实验室的仪器设备 及试剂要求，简化操作步骤，优化反应条件，建立 了适合于本实验室的一种简捷高效的检测方法。
离出 SVCV，但至今尚未发现治疗该病的有效药 物。目前国际上控制该病比较有效的措施是进行 监测，及早发现并进行隔离或扑杀，达到控制该病 暴发流行的目的。
现阶段，用于检测 SVCV 的方法主要有细胞 培养法、免疫学方法和分子生物学方法［6］。细胞 培养法在病毒学领域研究广泛，不仅作为病毒性 病原分离的经典方法，而且还可研究病毒的感染 机制以及抗病毒物质对病毒的作用方式和机理。 该方法是检验病毒病的传统方法，具有很高的准 确性，不易误诊。当某些毒力高、裂解性强的病毒 感染细胞时，细胞会出现损坏的组织学特征。本 研究中样品的组织匀浆液经过滤器过滤，可以去 除寄生虫和细菌，避免了其他因素对实验结果的 干扰，过滤液接种细胞 7 d 后，细胞仍没有发生变 化，但是经过盲传一代时，细胞出现皱缩、变圆、死 亡的现象。再次用病变细胞冻存液作为病原接种 细胞时，细胞出现同样的病变现象。这一结果可 证明检测样品中含有病毒性病原。
（ 下转第 38 页）
表 1 病毒的滴度测定结果
病毒稀释度
100 10 － 1 10 － 2 10 － 3 10 － 4 10 － 5 10 － 6 10 － 7 10 － 8 10 － 9
细胞孔数
8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
病变孔数
8 8 8 7 7 7 2 2 1 1
无病变孔数
0 0 0 1 1 1 6 6 7 7
计算公式：
l g TCID50 = 高于 50 % CPE 的稀释度对数 +
距离比例 × 稀释系数的对数
（ 1）
距离比例 = （ 高于 50 % CPE 率 － 50） / （ 高于
ຫໍສະໝຸດ Baidu
50 % CPE 率 － 低于 50 % CPE 率）
（ 2）
2． 3 分子 PCＲ 方法的鉴定结果
病样组织分别采用针对 SVCV 糖蛋白基因的
32 doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1994． 2014． 01． 008
水产科技情报 2014，41（ 1）
一株鲤春病毒血症病毒的初步分离及鉴定
安伟 肖雨 张崇文 张明辉 何正侃 ( 上海市水产研究所、上海市水生动物疫病预防控制中心( 筹) ，上海 200433)
累计总数
病变数 51 43 35 27 20 13 6 4 2 1
无病变数 0 0 0 1 2 3 9 15 22 29
病变比
51 /51 43 /43 35 /35 27 /28 20 /22 13 /16 6 /15 4 /19 2 /24 1 /30
病变率 /%
100 100 100 96． 4 90． 9 81． 25 40 21． 6 8． 3 3． 3
鲤 春 病 毒 血 症 病 毒 （ Spring Viremia of Carp Virus，简称 SVCV） 是一种弹状病毒，它可以引起 鲤科鱼类大规模暴发鲤春病毒血症（ SVC） ，该病 广泛流行于欧洲的鲤鱼养殖［1］。同 其他鱼类弹 状病毒一样，SVCV 感染是致死性的，临床表现为 水肿和出 血 症 状。 当 感 染 鱼 发 病 时，其 肾 脏，脾 脏，鳃和脑中含有大量的病毒［2］。SVC 为世界动 物卫生组织（ OIE） 规定的必须呈报的疫病之一， 中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动 物一、二类传染病、寄生虫病名录》（ 2008） 中的一 类动物疫病。由于 SVC 潜伏期短，外部症状不明 显、不典型，容易误诊而造成重大损失，所以要加 强 SVC 的预防措施，即建立快速准确的检测方法 监测该疾病的流行情况。病毒检测技术主要是采 用细胞培养的方法分离病毒，然后利用免疫学方 法，如中和试验、免疫荧光、免疫过氧化酶或酶联 免疫吸附（ ELISA） 等技术进行鉴定。随着现代生 物技术的快速发展，分子生物学方法检测技术在 病原检测领域广泛应用，PCＲ 方法通过检测核苷 酸可以快速准确地鉴定病原，灵敏度高［3］。笔者
（ A． 正常 EPC 细胞； B． 疑似 SVCV 病样感染的 EPC 细胞）
图 1 SVCV 感染 EPC 细胞的病变效应 （ 10 × 10 倍镜下观察）
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水产科技情报 2014，41（ 1）
2． 2 病毒滴度的测定
SVCV 能在 EPC 细胞中稳定地增殖，其病毒 滴度 TCID50 /0． 1 mL = 105． 76 （ 见表 1） 。
取病样的肾脏和脾脏，加入 10 倍的 PBS，用 组织匀浆器充分研磨，匀浆液在 － 80 ℃ 反复冻融 3 次，然后按 5 000 r·min － 1 离心 20 min，将上清液 经 0． 22 μm 滤膜过滤除菌，得病毒液，于 － 80 ℃ 保存备用。
收稿日期： 2013 － 08 － 20 作者简介： 安伟（ 1984—） ，男，助理工程师，主要从事鱼类病害防治技术研究。 通讯作者： 肖雨（ 1960—） ，女，高级工程师，主要从事水产养殖病害防治技术研究。
摘 要： 为了检测上海市某鲤鱼养殖场的疑似患病鲤鱼是否携带鲤春病毒血症病毒（ SVCV） ，采用鲤鱼表 皮瘤细胞系（ EPC） 进行病毒分离和分子 PCＲ 方法对 SVCV 的糖蛋白基因保守区域进行扩增。试验结果： 被病毒感染的 EPC 细胞呈现细胞圆缩、颗粒增多、大量脱落等病变特征，且该株病毒毒力较强，其病毒滴 度 TCID50 /0． 1 mL 为 105． 76 。分子方法扩增出 714 bp 和 606 bp 的 SVCV 的保守片段。试验采用细胞培养 技术和分子 PCＲ 方法检测样品是否携带病毒性病原，建立了一种较为简捷高效的检测方法。该方法适合 在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫任务，具有良好的应用前景。 关键词： 鲤春病毒血症病毒（ SVCV） ； 细胞分离； PCＲ 检测； 鲤
dd H2 O 3 μL，于 65 ℃ ，5 min 后冰上急冷，再加入 Buffer 4 μL，ＲNase 0． 5 μL，ＲTase 1 μL，dd H2 O 4． 5 μL，于 30 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min 进行逆转录反应。 1． 5． 3 PCＲ 方法的鉴定