抗真菌药物筛选模型
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化学合成的抗真菌抗生素
如：咪唑类，三唑类
微生物来源的抗真菌药物
如：多烯类抗生素
1.3抗真菌药物作用机制
① 作用于真菌细胞膜中醇合成的抗真菌药 物
② 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物 ③ 作用于核酸合成的抗真菌药物
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法
选择毒性小的代表性真菌作为试验菌， 采用管碟法或者纸片法测定样品对试验的 抑制或杀伤活性。
2.12 纸片法
与管碟法类似，用无菌过滤纸片沾取药物 贴在真菌培养基上，观察菌落情况。
传统方法固然存在许多缺点，但由于操作 简单和处理量大，非常适合微生物发酵样 品初筛。
2.2定靶的筛选方法
目前发现作用于真菌的靶位有三种途径：
① 真菌结构成分及代谢产物分析； ② 真菌产物的生物合成途径及其相关酶分子的研究； ③ 控制真菌生长和细胞分裂的基因序列分析。
检测菌孢子制备
取冻干管中菌接种到沙氏斜面，28oC培养；白色念珠菌培 养24h，表皮癣菌96h，新型隐球菌48h；
然后分别传代，培养至子三代；取孢子长势良好的子斜面 1支加入灭菌生理盐水5ml，用接种环刮下孢子，转移至盛 有玻璃珠的三角瓶。
同样方法处理3次，孢子液合并于三角瓶，轻轻震荡30min， 然后过滤得孢子悬液。
文献报道应用这种方法筛选出许多β-1,3葡聚糖合成酶抑制 剂化合物如arborcandins A~F等。
2.2.1.2 甘露聚糖合成酶抑制剂
甘露聚糖是真菌细胞壁组成中三种多糖之 一，对细胞壁的功能起到十分重要的作用。
甘露聚糖合成酶抑制剂筛选模型
分离啤酒酵母的甘露聚糖合成酶，以[14C]GDP-甘露聚糖为 底物。反应混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、 20mmol/L二甲基砷酸盐缓冲液（pH6.5）、10mmol/L MnCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、待测样品和甘露聚糖合成酶， 25oC反应30min，使用纸层析测定多聚物。
几丁质合成酶抑制剂筛选模型
筛选方法类似于甘露聚糖合成酶抑制剂方法。
尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是两类几 丁质合成酶抑制剂，因其结构与几丁质的前提尿苷二磷酸 N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）类似而竞争性抑制几丁 质合成酶。
2.2.2 真菌细胞膜合成抑制剂
抗真菌药物筛选模型
励飞小组制作
目录
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点 1.2抗真菌药物类型 1.3抗真菌药物作用机制
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法 2.2定靶的筛选方法
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点
顽固性 广泛性 新生性 严重性
1.2抗真菌药物类型
真菌细胞膜是一种渗透屏障，可作为小分 子和信号传导的通路。
细胞膜由来自百度文库脂类、鞘脂类和固醇类物质组 成，为各种功能蛋白提供基本的骨架。
2.2.2.1麦角固醇生物合成抑制剂
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组分， 在真菌生活中其重要作用。
一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦 角甾醇生物合成途径中不同环节的酶，干 扰真菌麦角甾醇生物合成，发挥抗真菌作 用。
普纳米星（pradimicin）类和贝娜诺霉素（benanomicin） 类在存在Ca2＋的条件下，其有力羧基与细胞表面甘露聚糖 蛋白质复合物的多糖部分络合，导致细胞壁结构异常而破 裂，细胞膜通透性增加，胞内钾外漏而致细胞死亡。
2.2.1.3 几丁质合成酶抑制剂
几丁质是β-(1,4)糖苷键连接的N-乙酰胺基葡 萄糖(GlcNAc)的链状聚合物，是细胞壁的支 架结构。几丁质合成酶催化GlcNAc在细胞膜 上聚合成几丁质，在真菌细胞的分裂和成 熟中起了重要作用。
2.2.1真菌细胞壁合成抑制剂筛选
大多数真菌细胞壁成分包括：几丁质，-β葡 聚糖，α-葡聚糖和各种甘露聚糖蛋白。
2.2.1.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂
β-1,3葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分，但 并不出现在人类和其他哺乳动物细胞。因 此β-1,3葡聚糖的合成被期望成为筛选特异 性抗真菌抗生素的理想靶位。
日本Ohayama建立的筛选模型
提取白色念珠菌和烟曲霉的β-1,3葡聚糖作为反应酶，酶反 应混合物（100ul含）含有 75mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、 0.75mmol/L EDTA、0.75％BSA、1mmol/L UDP-葡萄糖和 0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖（519mCi/mmol）。在酶反应 混合物中加入5ul酶溶液，在30oC培养60min，加入100ml冰 冷的20％三氯乙酸溶液终止反应。滤纸过滤获得沉淀物， 先后使用10％的三氯乙酸和95％的乙醇洗涤、风干，加入 100ml的液闪试剂，使用液闪仪测定放射活性。计算酶活 性，筛选时在酶反应混合物中加入测定样品。
2.1.1 管碟法
以白色 念珠菌为指示菌，对微生物进行筛 选。
检测菌的培养基：
1. 马铃薯培养基：蔗糖1.5％，马铃薯2.0％，琼脂2.0%,pH 自然；
2. 沙氏培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5％，葡萄糖4.0％， 琼脂2.0％，pH自然。
发酵样品处理主要用超声处理，过滤得上 清液，经过无菌过滤。
② 取灭菌的300ul沙氏液体培养基，以每孔50ul的量加入到 96孔细胞培养板的个孔中；取50ul样品溶液分别加入到96 孔板的第1行个孔中（从第2列开始留1列作空白对照）， 每1列从第1行开始依次倍半稀释到最后一孔（即第8行）， 然后在 28oC培养16～18h，在倒置显微镜下观察孢子生长 的菌丝形态，判断其活性，计算最小活性浓度。
取原液和稀释液两个浓度的孢子悬液，用血球计数仪计数， 结果分别为3.6×106个/ml、3×106个/ml、5.0×106个/ml.
筛选抗真菌活性
① 取无菌平板加底层沙氏培养基20ml，凝固。取制得的单 孢子悬液，将合适的菌液加入48oC保温的100ml沙氏培养 基中轻轻摇匀。再取5ml注入底层培养基上，摇匀制成含 菌平板。待平板凝固后，取4支无菌钢杯按等距离排放， 一个加入酮康唑对照品，另3个加入受试样品，于28oC培 养3d，观察抑菌圈。
如：咪唑类，三唑类
微生物来源的抗真菌药物
如：多烯类抗生素
1.3抗真菌药物作用机制
① 作用于真菌细胞膜中醇合成的抗真菌药 物
② 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌药物 ③ 作用于核酸合成的抗真菌药物
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法
选择毒性小的代表性真菌作为试验菌， 采用管碟法或者纸片法测定样品对试验的 抑制或杀伤活性。
2.12 纸片法
与管碟法类似，用无菌过滤纸片沾取药物 贴在真菌培养基上，观察菌落情况。
传统方法固然存在许多缺点，但由于操作 简单和处理量大，非常适合微生物发酵样 品初筛。
2.2定靶的筛选方法
目前发现作用于真菌的靶位有三种途径：
① 真菌结构成分及代谢产物分析； ② 真菌产物的生物合成途径及其相关酶分子的研究； ③ 控制真菌生长和细胞分裂的基因序列分析。
检测菌孢子制备
取冻干管中菌接种到沙氏斜面，28oC培养；白色念珠菌培 养24h，表皮癣菌96h，新型隐球菌48h；
然后分别传代，培养至子三代；取孢子长势良好的子斜面 1支加入灭菌生理盐水5ml，用接种环刮下孢子，转移至盛 有玻璃珠的三角瓶。
同样方法处理3次，孢子液合并于三角瓶，轻轻震荡30min， 然后过滤得孢子悬液。
文献报道应用这种方法筛选出许多β-1,3葡聚糖合成酶抑制 剂化合物如arborcandins A~F等。
2.2.1.2 甘露聚糖合成酶抑制剂
甘露聚糖是真菌细胞壁组成中三种多糖之 一，对细胞壁的功能起到十分重要的作用。
甘露聚糖合成酶抑制剂筛选模型
分离啤酒酵母的甘露聚糖合成酶，以[14C]GDP-甘露聚糖为 底物。反应混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、 20mmol/L二甲基砷酸盐缓冲液（pH6.5）、10mmol/L MnCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、待测样品和甘露聚糖合成酶， 25oC反应30min，使用纸层析测定多聚物。
几丁质合成酶抑制剂筛选模型
筛选方法类似于甘露聚糖合成酶抑制剂方法。
尼克霉素（nikkomycin）和多氧霉素（polyoxin）是两类几 丁质合成酶抑制剂，因其结构与几丁质的前提尿苷二磷酸 N-乙酰胺基葡萄糖（UDPNlcNAc）类似而竞争性抑制几丁 质合成酶。
2.2.2 真菌细胞膜合成抑制剂
抗真菌药物筛选模型
励飞小组制作
目录
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点 1.2抗真菌药物类型 1.3抗真菌药物作用机制
2.抗真菌药物的筛选方法
2.1传统的筛选方法 2.2定靶的筛选方法
1.抗真菌药物综述
1.1真菌致病特点
顽固性 广泛性 新生性 严重性
1.2抗真菌药物类型
真菌细胞膜是一种渗透屏障，可作为小分 子和信号传导的通路。
细胞膜由来自百度文库脂类、鞘脂类和固醇类物质组 成，为各种功能蛋白提供基本的骨架。
2.2.2.1麦角固醇生物合成抑制剂
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组分， 在真菌生活中其重要作用。
一些不同类型的化合物通过作用于真菌麦 角甾醇生物合成途径中不同环节的酶，干 扰真菌麦角甾醇生物合成，发挥抗真菌作 用。
普纳米星（pradimicin）类和贝娜诺霉素（benanomicin） 类在存在Ca2＋的条件下，其有力羧基与细胞表面甘露聚糖 蛋白质复合物的多糖部分络合，导致细胞壁结构异常而破 裂，细胞膜通透性增加，胞内钾外漏而致细胞死亡。
2.2.1.3 几丁质合成酶抑制剂
几丁质是β-(1,4)糖苷键连接的N-乙酰胺基葡 萄糖(GlcNAc)的链状聚合物，是细胞壁的支 架结构。几丁质合成酶催化GlcNAc在细胞膜 上聚合成几丁质，在真菌细胞的分裂和成 熟中起了重要作用。
2.2.1真菌细胞壁合成抑制剂筛选
大多数真菌细胞壁成分包括：几丁质，-β葡 聚糖，α-葡聚糖和各种甘露聚糖蛋白。
2.2.1.1 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂
β-1,3葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分，但 并不出现在人类和其他哺乳动物细胞。因 此β-1,3葡聚糖的合成被期望成为筛选特异 性抗真菌抗生素的理想靶位。
日本Ohayama建立的筛选模型
提取白色念珠菌和烟曲霉的β-1,3葡聚糖作为反应酶，酶反 应混合物（100ul含）含有 75mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、 0.75mmol/L EDTA、0.75％BSA、1mmol/L UDP-葡萄糖和 0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖（519mCi/mmol）。在酶反应 混合物中加入5ul酶溶液，在30oC培养60min，加入100ml冰 冷的20％三氯乙酸溶液终止反应。滤纸过滤获得沉淀物， 先后使用10％的三氯乙酸和95％的乙醇洗涤、风干，加入 100ml的液闪试剂，使用液闪仪测定放射活性。计算酶活 性，筛选时在酶反应混合物中加入测定样品。
2.1.1 管碟法
以白色 念珠菌为指示菌，对微生物进行筛 选。
检测菌的培养基：
1. 马铃薯培养基：蔗糖1.5％，马铃薯2.0％，琼脂2.0%,pH 自然；
2. 沙氏培养基：蛋白胨1.0%，氯化钠0.5％，葡萄糖4.0％， 琼脂2.0％，pH自然。
发酵样品处理主要用超声处理，过滤得上 清液，经过无菌过滤。
② 取灭菌的300ul沙氏液体培养基，以每孔50ul的量加入到 96孔细胞培养板的个孔中；取50ul样品溶液分别加入到96 孔板的第1行个孔中（从第2列开始留1列作空白对照）， 每1列从第1行开始依次倍半稀释到最后一孔（即第8行）， 然后在 28oC培养16～18h，在倒置显微镜下观察孢子生长 的菌丝形态，判断其活性，计算最小活性浓度。
取原液和稀释液两个浓度的孢子悬液，用血球计数仪计数， 结果分别为3.6×106个/ml、3×106个/ml、5.0×106个/ml.
筛选抗真菌活性
① 取无菌平板加底层沙氏培养基20ml，凝固。取制得的单 孢子悬液，将合适的菌液加入48oC保温的100ml沙氏培养 基中轻轻摇匀。再取5ml注入底层培养基上，摇匀制成含 菌平板。待平板凝固后，取4支无菌钢杯按等距离排放， 一个加入酮康唑对照品，另3个加入受试样品，于28oC培 养3d，观察抑菌圈。