蔗糖酶的分离提纯讲解
酵母蔗糖酶的分离、纯化及酶动力学分析 -1
安徽农业大学 生命科学学院 2017年11月
自溶
蔗 糖 酶 分 离 纯 化
抽提 1.监测蔗糖酶活性变化 --DNS试剂法 乙醇分级 2.监测蛋白浓度变化 --考马斯亮蓝G250染色法 透析 脱盐
纯度和产量 计算
蔗糖酶 动力学 分析
米氏常数Km的测定 pH对酶活性的影响
9.7
7.37
3.53
3.操作步骤
自行设计实验方案！！！！
以反应pH为横坐标，绘制pH～酶活性曲线，并分析本实 验条件下该酶的最适pH范围。
实验报告的要求
一、实验报告组成 1.实验目的 2.实验原理 3.实验步骤 4.注意事项 5.实验结果、分析与讨论
（1）交代清楚所有数据来源，所有数据的计算过程，注意图 表的绘制，等。 （2）针对图表针对性的进行分析。
加水mL数
9
8
7
6
3.操作步骤
管号 蔗糖终浓度 [S]mmol/L 1/[S] V 1/V [S]/V
1
2
3
4
用二种方法作图： （1）倒数作图法：1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标，由直线在横轴上的交点为 －1/Km，计算得Km； （2）[S]/V对[S]作图，以[S]/V为纵坐标，以[S]为横坐标，由直线在横轴上的 交点为-Km。
分离、纯化操作步骤
4.纯度和产量
提纯的目的，不仅在于得到一定量的酶,而且要求得到不会或尽量少含其他 杂蛋白的酶制品。在纯化过程中，除了要测定一定体积或一定重量的酶制剂中 含有多少活力单位外，还需要测定酶制剂的纯度。酶的纯度用比活力表示。
酵母蔗糖酶分离纯化效果计算
留样 体积 /mL 蛋白质浓度 （mg/mL） 总蛋白 活力 总活力 比活力 （mg） （U/mL） （U） （U/mg） 纯化 倍数 产量 （回收率）
蔗糖酶的分离提取及活力测定
6 2.4
1.2
0.8
3.0
7 2.8
1.4
0.6
3.0
3、蔗糖酶的活力测定：
①.蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3min释 放1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 ②.操作： 取两支试管分别加入
液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管； 把两支试管和5%的蔗糖溶液都放在35℃水浴中预热恒 温；上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液，并准
我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自 溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用 组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的 物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
2）抽提：
抽提（或叫萃取）是将已破碎细胞壁的材料 置于一定的条件及溶剂中，使被提取物释放出来 的过程。
一、目的要求
1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖 的原理和方法； 2.学习酶蛋白分离提取的原理； 3.学习掌握细胞破壁及抽提技术； 4.学习掌握酶活力测定及其计算的方法。
二、实验原理
1、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理
强碱性溶液中
1）DNS试剂+ D-葡萄糖 沸水浴中 氨基化合物
氨基化合物
（还原糖）
沸（水棕浴红中色）
3）在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成一
定比例关系，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
4）在一定条件下，蔗糖酶催化反应产生D-葡萄糖的量一
定。所以，可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力。
3、蔗糖酶分离提取的原理
1）细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为 胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶 时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取， 得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁 的方法也不同。
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖⽔解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化⾮还原糖中的α—呋喃果糖苷键⽔解，具有相对专⼀性。
不仅能催化蔗糖⽔解⽣成葡萄糖和果糖，也能催化棉⼦糖⽔解，⽣成密⼆糖和果糖。
每⽔解1mol 蔗糖，就⽣成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种⽅法，本实验采⽤Nelson ⽐⾊法测定还原糖量，由此可得知蔗糖⽔解的速度。
在研究酶的性质、作⽤、反应动⼒学等问题时都需要使⽤⾼度纯化的酶制剂以避免⼲扰。
酶的提纯⼯作往往要求多种分离⽅法交替应⽤，才能得到较为满⾜的效果。
常⽤的提纯⽅法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离⼦交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋⽩在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能⾼的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验⽤新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，⼄醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进⾏测定。
⼀、蔗糖酶的提取与部分纯化（⼀）实验⽬的学习酶的提取和纯化⽅法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供⼀定量的蔗糖酶。
（⼆）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1. ⾼速冷冻离⼼机、恒温⽔浴箱、－20℃冰箱2. 电⼦天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离⼼管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. ⽯英砂（海沙）、甲苯（使⽤前预冷到0℃以下）3. 95%⼄醇（预冷－20℃）、去离⼦⽔（使⽤前冷⾄4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液（四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离⼼10 min，除去⼤量⽔分。
实验操作指导书：蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下）4. 去离子水（使用前冷至4℃左右）5. 冰块、食盐6. 1N乙酸7. 95%乙醇三、仪器：1. 研钵1个2. 离心管3个3. 滴管3个4. 量筒50ml 1个5. 水浴锅1个6. 恒温水浴7. 烧杯100ml 2个8. 广泛pH试纸9. 高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。
二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。
剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。
2. 热处理（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
蔗糖酶的提取过程的原理
蔗糖酶的提取过程的原理蔗糖酶是一种重要的酶类物质，其作用是分解蔗糖，将其转化为葡萄糖和果糖等单糖。
蔗糖酶现已被广泛应用于工业和食品加工等领域，因此对于蔗糖酶的提取过程和原理的研究十分重要。
蔗糖酶的提取原理：蔗糖酶主要是存在于细胞内的酶类物质，在提取过程中需要破碎细胞壁、细胞膜等障碍物，使酶类物质释放出来。
因此，蔗糖酶的提取过程可步骤分为细胞破碎、酶的提取、分离纯化等环节。
细胞破碎细胞破碎是蔗糖酶提取的第一步，其目的是将细胞壁、细胞膜等保护层破碎，以便获得高含量的酶液。
细胞破碎主要有三种方法：物理方法、生物方法、化学方法。
物理方法：包括高压破碎法、超声波破碎法、微波破碎法等技术，其中高压破碎法是最为常用的破碎方法，可通过高压融合，将含有酶的细胞破裂。
生物方法：是利用生物体内酶的辅助作用，通过胰蛋白酶等酶的介入，使细胞膜被破坏，从而释放出酶来。
化学方法：通过化学物质对生物组织进行不同程度的破坏，使细胞膜等基本单位出现裂缝，酶液就可以自由地流出。
酶的提取酶的提取是蔗糖酶提取过程的第二步，其目的是从破碎的细胞内提取蔗糖酶。
酶的提取常用的方法有：水解法、溶剂法、膜过滤法等技术。
水解法：是指通过水解反应从生物物质中分离有用成分的方法。
例如，将蔗糖酶浸泡在50温水中，持续2小时左右，使蔗糖酶转化成有利于提取的热变性酶。
溶剂法：即将蔗糖酶和溶剂混合，应用分离纯化技术获得有用的酶液。
溶剂法有界面法、反相分配法、油相萃取法、溶液萃取法等。
膜过滤法：是利用一定的压力，将蔗糖酶溶液通过一定孔径大小的膜片，将酶体分离纯化出来。
分离纯化分离和纯化是蔗糖酶提取过程中的最后一步，其目的是获得高纯度和高活性的酶液。
常用的分离和纯化技术有：离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和色谱法等。
其，默认是将酶液溶液经某些方法处理后，将酶从其他的杂质中过滤出来，其中离子交换层析法是最为常用的手段。
在这种方法下，蔗糖酶分子通过吸附原理与活性生物载体进行相互作用，去除杂质，实现酶活性的提高和纯度的提高。
蔗糖酶的分离提纯
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
试验二 离子互换柱层析分离纯化蔗糖酶
一、试验目旳和要求 1、学习离子互换层析旳基本原理； 2、学习离子互换层析分离蛋白质旳基本措施和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测旳基本原理和措施。 二、试验基本原理 1、离子互换层析
离子互换层析是常用旳层析措施之一。它是在以离子互换剂为固定相，液 体为流动相旳系统中进行旳。离子互换剂与水溶液中离子或离子化合物旳反 应主要以离子互换方式进行，或者借助离子互换剂上电荷基团对溶液中离子 或离子化合物旳吸附作用进行。这些过程都是可逆旳。在某一pH值旳溶液中， 不同旳蛋白质所带旳电荷存在差别，因而与离子互换剂旳亲和力就有区别。 当洗脱液旳pH变化或者盐旳离子强度逐渐提升时，使某一种蛋白质旳电荷被 中和，与离子互换剂旳亲和力降低，不同旳蛋白质按所带电荷旳强弱逐一被 洗脱下来，到达分离旳目旳。
综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化
综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化（一）实验目的学习酵母蔗糖酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理酶是生物体内具有催化活性的物质，在人类生产生活和生命过程中起着非常重要的作用。
因此，酶学相关研究始终是生物学的重大课题。
酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及收率可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法进行分离，同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶，属于水解酶类，催化蔗糖分解成D-葡萄糖和D-果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。
目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。
工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。
蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式：存在于细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶和细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
外蔗糖酶活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶。
酵母细胞的破壁方法主要有研磨法、酶解法、反复冻融法、超声波破碎法等[8]。
酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。
超声波破碎法具有空化效应，产生机械剪切压力使细胞破碎，耗时短、费用低，损耗小。
本实验采用超声波破碎法破碎酵母细胞。
（三）实验仪器、材料及试剂1.仪器（1）美国SONICSVCX 750型超声波细胞破碎仪、Eppendorf多功能台式离心机5804R、恒温水浴箱、-20℃冰箱、电子天平、制冰机（2）离心管（2ml、1.5ml、50ml）、移液器、滴管、50ml量筒、50ml烧杯、玻璃棒2.材料及试剂（1）活性酵母粉（市售安琪酵母粉）（2）0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH5.0）（3）95%乙醇（预冷-20℃）（四）操作步骤1.超声波法破碎酵母细胞（1）称取10g干酵母粉，放入冰预冷的50ml烧杯中，再加入30ml冰预冷的0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液，用玻璃棒搅拌均匀成糊状液体。
生物化学实验-蔗糖酶的提取
三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人）
2、实验试剂
⑴ 石英砂，
⑵ 95% 乙醇(-20℃），
⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。
五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。
1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细 粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移 到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分 钟，收集上清液（样品I）并量出体积V1,另留1ml上清液（标注样品I ）放 置－20℃冰箱保存，用于后续实验。
七、思考题 本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为Leabharlann 有哪些方法可以运用？说说你的设想。
下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
蔗糖酶的分离提纯及酶促ppt演示课件
3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物， 其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比；
在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比 紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们 选用本方法。
蔗糖酶的分离提纯及酶促 反应动力学实验
（综合性大实验）
课件制作、讲授及实验指导：郭慧云
01.02.2021
1
内容提示
本实验含如下内容（1、2、3是酶分离提纯及比活力测
定部分的内容；4、5是酶促反应动力学部分的内容）：
1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的 制
作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（酶活力）； 2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗
2
一、目的要求
1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项；
2.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法；
3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
4.学习酶蛋白分离提纯的原理；
5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱
层析技术；
6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；
01.02.2021
12
5、柱层析的准备工作
装置
①组装层析
②装柱、柱平衡（过夜）
01.02.2021
13
6、 柱层析（制E3） 周五下1：00开始
① 离心（得E2 ）
实验1 蔗糖酶的提取
你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。
显示 桌面 .scf
下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
预习参考资料
李建武等 生物化学实验原理和方法
北京大学出版社
赵永芳 生物化学技术原理及应用（第三版） 科学出版社
3、有机溶剂（乙醇）沉淀：
将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温
和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管 平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰 箱保存，以备用于下周实验——实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。 六、实验结果分析讨论
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
压力和研磨
物理法、化学渗透法、酶溶
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把 蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进
行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯
度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到
蔗糖酶分离纯化与活力测定
考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮兰G 250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。 考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。 在酸性溶液时呈茶棕色 465nm 当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm， 10595nm 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比 蛋白质浓度范围内成正比； 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比； 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数， 线的直线范围内 根据所测定的A595nm值 在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量， 根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量， A595nm 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL) 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)
热处理和乙醇沉淀
预先将恒温水浴调到50℃ 将盛有粗级分I 50℃， (1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 下保温30分钟， 地放入水浴中，50℃下保温30分钟 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻 摇离心管。 摇离心管。 取出离心管， 冰浴中迅速冷却， 4℃，10000rpm， (2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离 10min。 心10min。 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（ (3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒 入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇 ），逐滴加入等体积预冷至 乙醇， 入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇， 同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟， 30分钟 10分钟 同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟， 以沉淀完全。 4℃，10000rpm，离心10min 倾去上清， 10min， 以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清， 并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口， 并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然 后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ ）。 后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
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蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
二、蔗糖酶的分离提纯1．蔗糖酶粗品的制备(1)自溶称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠。
然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。
(2)提取及粗酶的制备往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。
第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。
取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。
得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。
量出粗酶液体积，记录。
取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。
2．乙醇分级将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。
(1)32％乙醇饱和度按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。
X 1/（V+X1）=O.32式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。
然后再按X1／0.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32％时所需95％乙醇的体积。
把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。
小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则会引起酶变性失活。
在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。
上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。
(2)47.5％的乙醇饱和度按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量X2/(V+X2)=0.475式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。
再按X2／0.95算出需95％乙醇的体积。
按下式可算出使乙醇浓度达47．5％时所需补加的95％乙醇体积。
X2/0.95- X1/0.95=使乙醇浓度达47．5％时需补加的95％乙醇体积按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5％于3000r／min离心3min，弃去上清会得少量沉淀。
将沉淀用10mL pH6.0的0.005mol／L磷酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌情缩短时间，中间换一次透析液。
离心，则得到进一步纯化的酶。
量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。
其他酶液准备上柱。
3．DEAE一纤维素柱层析(1)DEAE一纤维素处理在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除去过细部分，留下30min沉积部分，重复几次。
然后用0.5mol／L NaOH，水，0.5mol／L HCl，水，0.5mol／L NaOH，水，交替浸泡。
其中NaOH 浸泡2～4小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用水洗至中性。
最后用0.005mol ／L，pH6．0的磷酸钠起始缓冲液平衡。
再生方法：用过的DEAE一纤维素可再生重复使用。
但要先用0.5mol／L NaOH+0.5mol／LNaCl浸泡后再按常规处理。
DEAE一纤维素离子型。
水：R--N(CH3)2+H20==eR—N+(CH3)2H·OH-HCI：R—N+(CH3)2HOH-+HCl=R—N+(CH3)2HCl-+H2NaOH：R—N+(CH3)2H·Cl-+NaOH=R—N+(CH3)2H·OH-+Na+(2)装柱本实验使用的层析柱规格为1．8cm(内径)×15cm(高)。
把柱子垂直固定好，可用一千锤校正，按柱层析原理部分所述方法，把DEAE 一纤维素装柱。
床高距柱顶2～3cm为宜。
用起始缓冲液洗柱，平衡过夜。
注意控制流速，防止柱流干。
(3)上样乙醇分级的酶液，经对起始缓冲液透析，离心后，按层析原理部分所述方法上样。
（注意：流速要尽量慢，使目的酶和DE52充分吸附）样品上完后，用起始缓冲液(130mL)洗柱。
流出液流出速度为4mL／5min左右。
(4)洗脱用含0.15mol／L NaCl的0.005mol／L pH6.0的磷酸钠缓冲液洗脱。
洗脱速度4mL／5min。
收集20管即可结束。
(3～4mL／管)。
每隔一管测定活力，确定酶活力峰位置，合并，量出体积。
测合并后制剂的活力和蛋白浓度。
三、蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定1．蔗糖酶活力规定在本实验的条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
2．操作(1)样品的稀释取0.2mL无细胞抽提液(E1)用pH4.6，0.2mol／L NaAc缓冲液稀释40倍；取0.2mL乙醇分级酶液(E2)用上述缓冲液稀释80倍；DEAE--纤维素柱层析酶液(E3)根据情况稀释。
(2)反应取两支试管分别加入2mL稀释的酶液。
一支做对照，加0.5mL 1moL／L NaOH，摇匀，使酶失活；另一支做测定管。
然后把两支试管和5％的蔗糖溶液放在35~C 水浴中预热恒温。
分别取2mL 5％的蔗糖加入上述两试管中，并正确计算时间，3min于测定管中加入0.5mL1mol／L NaOH，摇匀，终止反应。
从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3，5一二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。
于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷却，加蒸馏水稀释到25mL刻度，摇匀，于540nm测光密度。
在葡萄糖标准曲线上找到所测光密度对应的葡萄糖含量，然后按下面活力计算公式计算酶活力。
3．酶活力计算公式蔗糖酶活力单位：葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数式中9=4.5/0.5，因酶反应液的总体积是4.5mL，而用3，5一二硝基水杨酸试剂显色时仅取0.5mL。
4．蛋白浓度测定E1稀释20倍；E2稀释4倍；E3不稀释。
Bradford法测蛋白浓度(见附注1)四、酶纯度鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定E1、E2和E3的纯度。
【结果的处理】附实验1Bradford法测定蛋白质含量【实验目的】掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】在蛋白质的分离、纯化过程中，往往需要有一种快速、灵敏的方法对蛋白质进行定量测定。
近年来被广为采用的Bradford法满足了人们的需要。
本方法采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliant blue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。
依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。
蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(0～1000µg/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。
该方法快速、重复性好、干扰因素少，CBB—G250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在l小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的于扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠，Triton x一100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照来消除。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)台称(2)721分光光度计(3)容量瓶(4)刻度试管和吸量管2．试剂(1)考马斯亮蓝G250溶液：称取CBB-一G250 lOOmg溶于50mL 95％的乙醇溶液中，然后加入100mL 85％的磷酸，最后加蒸馏水定容至1000mL。
(2)标准蛋白质溶液(100μg/mL)：精确称取100mg牛血清白蛋白，用0.9％氯化钠溶液定容至1000mL。
(3)生理盐水【实验操作】1．制作标准曲线取6支试管，按下表操作混匀，放置2min，于595nm处比色，记录光密度值(OD值)。
以蛋白质含量为横坐标，光密度值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定取2只试管，按下表操作：混匀，放置2min，于595nm处比色，查标准曲线，求得蛋白质含量。
注：样品用生理盐水稀释。
附实验2聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的纯度【实验目的】掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法和原理。
【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构的高分子聚合物，其网孔大小可由凝胶浓度加以调节。
因此用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物时，被分离物质由于所载电荷及其分子大小和形状的差异，在电场作用下以及凝胶网孔的“分子筛”作用下产生不同的移动速度而互相分离。
所以此方法具有电荷效应和“分子筛”效应的双重特性。
因为这一方法具有设备简单、操作方便、时间短、样品用量少、不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和分离蛋白质的有力工具。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)SCR型稳流稳压电泳仪(2)垂直板电泳槽及附件(3) 10mL注射器、100μL、10μL移液器(4)微量注射器、烧杯、移液管(5)真空泵2．试剂(1) pH8.9 Tris-HCl缓冲液（1号）：称取Tris 36.6g，lmol／L HCl 48 mL，TEMED 0.23mL，加重蒸馏水定容至100mL。