最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
最全的G418筛选稳定表达细胞系2前言在分子生物学领域中，稳定表达细胞系的制备是非常重要的。
而在制备稳定表达细胞系的过程中，G418耐受性筛选是最常用的一种方法。
本文就该方法进行细致的，希望对大家有所帮助。
G418的作用G418是一种广泛应用于细胞培养中的抗生素。
G418的主要作用是通过破坏靶细胞的核糖体的功能而发挥抗生素活性。
这依赖于靶细胞中的耐药性基因，通常经过转染或整体基因组编辑获得。
这些基因通常会转录RNA，并翻译成与蛋白质功能无关的药物代谢酶或其他抗性蛋白质。
筛选细胞系的基本流程G418的筛选过程是稳定表达细胞系的一部分。
经过瞬时转染或电穿孔后，与转染物质中的DNA共染色板并内化进入细胞。
在内化过程中，染色体或质粒DNA 可以在总体上被细胞机制视为异物并准备将其解除。
其中的一个解除机制是通过解除转录RNA，从而将它们从蛋白质生产途径中移除。
G418抑制暴露在表面的核糖体中的修饰基队的蛋白质的生产。
如果细胞体系不具有反抗力机制，则G418会破坏细胞并导致细胞死亡。
然而，通过特定酵母的CUP1锌指转录因子同源工程，使其对G418转化为一种有效的ATP结合剂，从而打开药物代谢酶表达。
可以在这些细胞中选择表达具有耐药性G418药物代谢酶的细胞，并在含有适量G418的培养基上进行培养和筛选。
筛选条件的优化G418抗性筛选过程具有一定的体系依赖性，因此筛选条件需要在洗脱和拍摄步骤之后进行优化。
根据选择的细胞线，典型的筛选条件是0.5mg/ml浓度的G418和2-4周的境况培养。
但是，这些条件可能需要优化以适应特定试验条件，例如在分子克隆中需要更强的选择并且可能需要更长的选育时间。
考虑到选择压连续存在的潜在影响，推荐根据具体情况进行测试并确定适当的药物添加量和持续时间。
稳定表达细胞系的优点与瞬时转染相比，生成稳定表达细胞系有很多优点。
首先，它们可以被保存和用于长期研究，免受数据库变化和反常的实验结果的影响。
G418筛选
从G418筛选，转染到xx化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种，，细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时细胞孔内大约50%汇合度。
理论上孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察孔内有两三个克隆，按比例孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
Protocal1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
G筛选稳定表达细胞系经验总结
G筛选稳定表达细胞系经验总结Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
G418筛选细胞(整合版)
G418筛选细胞G418简介：G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：108321-42-2分子式：C20H40N4O10?2H2SO4 分子量：692.71[储运] 室温下运输, 干粉在室温下储存，溶液于-20℃储存。
G418工作原理：它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
利用G418筛选细胞：1、准备工作在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。
每种细胞对G418 的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。
《分子克隆》给出的几个常用细胞系所需G418 的最佳用量：2、确定最佳筛选浓度最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
①将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板。
②G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml 等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。
筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
★汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！3、加药时间①一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选（由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PB Ｓ。
我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。
HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaO Ｈ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。
Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。
特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。
ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。
Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼m ｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
转染、G418筛选、单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%加药时间和维持浓度2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。
筛选时的培养液1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液3，适当增加血清浓度。
1，问题1。
做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。
2，问题2。
筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。
一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。
这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。
想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。
不过，我转的是一种抑癌基因。
5，从单克隆化时开始，就要加大营养，血清清和生长因子。
方法1：单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
G418筛选
G418筛选G418、新霉素与neoG418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo 就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
看下面的一个试验:3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% ～加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。
这时会出现两个问题:1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。
G418筛选细胞(整合版)
G418筛选细胞G418简介：G418是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：108321-42-2分子式：C20H40N4O10?2H2SO4 分子量：692.71[储运] 室温下运输, 干粉在室温下储存，溶液于-20℃储存。
G418工作原理：它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
利用G418筛选细胞：1、准备工作在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。
每种细胞对G418 的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。
《分子克隆》给出的几个常用细胞系所需G418 的最佳用量：2、确定最佳筛选浓度最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
①将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板。
②G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。
筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
★汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！3、加药时间①一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选（由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆）。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
稳定表达蛋白的细胞系筛选方法
稳定表达蛋白的细胞系筛选方法实验目的建立可稳定表达蛋白的细胞系。
实验原理外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，最终整合进细胞染色体。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（Neo抗性基因）携带的氨基糖苷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当 neo 基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能动neo 基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
G418筛选预实验：由于各真核细胞系对G418 敏感度不同，各新细胞系或株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量需要通过实验优化。
最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
将细胞稀释至1000 cell/mL，每孔100 ul 加入有培养基的24 孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 ug/mL等12个级别，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800 ug/mL左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
操作步骤1. 质粒转化及扩增按照常规操作步骤将质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取单个克隆质粒抽提，进行酶切测序验证无误后扩增细菌，抽提质粒备转染用。
2. 细胞转染及筛选将细胞接种于6孔板，约70％密度无血清无抗生素条件下，按照脂质体Lipofectmine 2000（Invitrogen）说明书中的剂量，使用质粒及脂质体进行转染，同时设空白对照。
6 h后改用含血清及抗生素的培养基（根据细胞密度添加血清），转染结束后24 h加G418进行筛选，以最低致死浓度筛选，根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PBＳ。
我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。
HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaOＨ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。
Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。
特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。
ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。
Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼mｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
G418筛选细胞(整合版)
G418筛选细胞G418简介：G418是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：108321-42-2分子式：C20H40N4O10?2H2SO4 分子量：692.71[储运] 室温下运输, 干粉在室温下储存，溶液于-20℃储存。
G418工作原理：它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
利用G418筛选细胞：1、准备工作在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。
每种细胞对G418 的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。
《分子克隆》给出的几个常用细胞系所需G418 的最佳用量：2、确定最佳筛选浓度最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
①将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板。
②G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。
筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
★汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！3、加药时间①一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选（由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆）。
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Q：G418怎么配制？
A：我觉得不能用水配，因为这样PH会变化很大，至少要用PBS。
我是配在HEPES 溶液中的，具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。
HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。
Good answer:
推荐用HEPES。
特别是当细胞对G418不敏感，G418使用浓度高时，如果用水、PBS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mol/L HEPES 的简单配置：HEPES 11.91g，溶解于40ml的ddH2O，用10mol/L的NaOH调节pH至7.5-8.0，定容至50ml，0.22um小滤器过滤。
HEPES最终使用浓度
15-20mM。
Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆，如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过G418杀伤曲线，300ug\ml
就基本上可以杀死细胞，我想直接用1000ug\ml来筛选，不知是否可行？会不会有什么问题？
A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul 加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeocin，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度，结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度，确定最低致死浓度为600mg/l。
我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞，我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？
A: 应该保持这个浓度9天以上，每3天换液一次。
筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度的G418，一般在最低致死浓度的60%左右。
Q: 在6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选，2周后单克隆形成，于是就挑取单克隆，之前6孔板里的细胞很多，用0.125%typsin+0.25%EDTA消化，1000转/分离心10分钟，肉眼可以看到细胞沉淀，接种至25ml塑料培养瓶中，镜下看密度可以，但是细胞形态成多态性：少量是圆形，大多数是梭形。
第2
天一看没有细胞贴壁！做了2次都这样，请问我的操作步骤有问题吗？
A: 看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6 孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡，少数细胞存活并逐渐生长，只能叫作克隆形成。
我们一般在转染后24h将细胞消化下来（0.25%trypsin + 0.02%EDTA），以1：10或更高的比例传代，贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。
待大部分细胞死亡，极少数细胞渐形成克隆。
再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作（具体操作方法见附件）。
从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。
另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象，也可以在消化完用正常培养基，待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。
还有，在多克隆形成后一定要及时冻存，以备后续试验。
你挑选的克隆，不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少，那么你接种后，由于密度较低，细胞是接触生长，所以密度太低，细胞难以生存。
二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选，这样也会死亡。
消化后先用无G418的培养液培养，贴壁后，再换取G428 培养液。
Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来，我想着用刮勺，但进口的特别贵，所需又不多，你看有什么别的好办法吗？谢谢了！
A: 如何挑选克隆。
你可以按以下操作方法进行：
【操作方法】
（1）将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；
（2）在超净台内，弃去培养皿内的培养液；
（3）用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒；（有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS）
（4）将24孔培养板每孔加G418 选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。
镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上；（有人在细胞贴壁后再选用培养基）
（5）将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37℃5%CO2培养箱培养，2-5天；（6）待细胞长满后，0.25%Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。
Q: 用G418做HEp-2细胞的建系已经有2个月了，已经在细胞瓶中扩大培养，但发现与正常HEp-2细胞相比，建系的细胞生长得很慢，细胞间的边界也不是很清楚，而且细胞长得不均匀，这样正常吗？为改变这一状态，我该怎么做呢？谢谢！
A: 基本算正常吧。
稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等；有的则变化不明显。
对于稳定转染的细胞，建议筛出单克隆后大量冻存。
一方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。
在传代过程中，也可以使用正常培养基，但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压，以除去回复的细胞。