大鼠灌注固定的方法
大鼠灌注固定的方法
大鼠灌注固定的方法大鼠灌注固定是一种用于研究大鼠生理和药理学的常见实验方法。
它可以用于评估药物的药代动力学、药效学和毒理学，并用于研究器官功能和疾病模型。
在进行大鼠灌注固定实验之前，需要仔细准备并按照以下步骤进行操作。
1.前期准备：- 选择适合实验目的的动物品种，通常是Sprague Dawley大鼠。
-清洁并消毒手术工具、试剂和仪器。
-准备一个有固定台架和支撑物的工作台，以便于操作。
2.动物处理：-使用静脉麻醉剂如七氟烷麻醉大鼠，确保其无感知和无痛苦。
-在动物体表部位使用剃刀去除毛发，以便于手术操作。
-放置大鼠在手术台上，用皮质骨钳或其他固定工具固定体位。
3.外周血管穿刺：-在大鼠的尾静脉或股静脉使用微注射针或导管进行外周血管穿刺。
通常选择尾静脉作为血液采集和药物给予的通路。
-确保穿刺位置干燥，避免出血和感染。
4.心脏灌注固定：-使用手术剪刀或手术刀在胸部进行中线切口，暴露出心脏。
-使用心脏夹固定心脏，并通过房室瓣作为固定点固定心脏。
-使用注射器注入适量的生理盐水或磷酸盐缓冲液，从主动脉穿刺注射，确保整个循环系统都能被灌注。
-如果需要，可以在注射液中加入药物或药物浓缩液以达到特定的实验目的。
5.清洗循环系统：-使用注射器缓慢注入生理盐水或磷酸盐缓冲液，并通过主动脉灌注整个循环系统。
-可以通过下腔静脉引流口清洗肝脏和肾脏，通过上腔静脉引流口清洗心脏，确保器官内的血液和残留物被冲洗干净。
6.完成实验：-在实验完成后，停止灌注并拔除总动脉穿刺点和外周血管穿刺点的引流器。
-使用生理盐水清洁手术切口，确保干燥和消毒。
-给予大鼠恢复期，通常是放置在恢复笼中，并观察其情况。
大鼠灌注固定是一种常见的实验方法，但它需要仔细的准备和操作。
在进行实验之前，需要评估和控制许多因素，如固定时间、注射液的成分和浓度，以及动物的恢复期。
此外，需要遵守相关的伦理和法律规定，确保动物的福利和保护。
通过正确使用和解释大鼠灌注固定实验的结果，可以为人类疾病的研究和治疗提供重要的信息。
大鼠灌注固定实验报告
一、实验目的1. 掌握大鼠灌注固定技术操作步骤。
2. 观察灌注固定后大鼠组织器官的结构变化。
3. 分析灌注固定过程中可能出现的问题及解决方法。
二、实验材料1. 实验动物：健康成年大鼠，体重200-250g。
2. 实验仪器：手术器械、手术显微镜、注射器、输液器、灌注针、剪刀、血管钳等。
3. 实验试剂：4%多聚甲醛固定液、生理盐水、注射用无菌注射用水等。
三、实验方法1. 动物处死：采用过量麻醉剂使大鼠处死，确保动物在处死过程中无痛苦。
2. 灌注固定：按照以下步骤进行大鼠灌注固定：（1）准备灌注液：将4%多聚甲醛固定液加入500ml输液用玻璃瓶中，加入适量生理盐水，搅拌均匀。
（2）解剖：在手术显微镜下解剖大鼠，暴露心脏。
（3）穿刺心脏：用灌注针从心脏穿刺，插入主动脉。
（4）灌注固定：将注射器连接到灌注针，缓慢注入固定液，直至大鼠肝脏逐渐变为白色。
（5）继续灌注：待肝脏变白后，继续灌注固定液，直至大鼠全身变白。
（6）终止灌注：观察大鼠四肢抽动，表明灌注液进入大脑，待抽动完全停止，全身组织器官固定良好。
3. 取材：将固定好的大鼠组织器官取出，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡。
四、实验结果1. 灌注固定后，大鼠组织器官结构清晰，细胞形态良好。
2. 部分大鼠在灌注固定过程中出现心脏破裂，导致灌注失败。
3. 部分大鼠在灌注固定过程中出现血压下降，需及时调整灌注速度。
五、实验讨论1. 灌注固定是研究组织器官形态结构的重要技术手段，操作过程中需严格按照步骤进行，确保固定效果。
2. 动物处死时，应避免过度麻醉，以免影响固定效果。
3. 灌注固定过程中，要注意观察动物的生命体征，及时发现并解决可能出现的问题。
4. 灌注固定液的选择应根据实验需求进行，如需观察细胞形态，可选择4%多聚甲醛固定液。
5. 实验过程中，要注意无菌操作，避免污染。
六、实验结论本次实验成功完成了大鼠灌注固定，取得了良好的固定效果。
通过观察灌注固定后大鼠组织器官的结构变化，为后续实验研究提供了良好的基础。
灌流取脑
大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。
2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。
3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。
小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。
4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。
5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。
时,剪开右心耳,使血液排出。
观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。
固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。
7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。
取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。
8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。
首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。
可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。
大鼠灌注固定的方法
大、小鼠灌注固定的方法准备物品：1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺）2、医用输液器3、500ml输液用玻璃瓶4、血管钳5、剪刀6、生理盐水7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。
左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。
取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。
多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。
如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。
如此灌注约需1小时时间。
充分暴露升主动脉套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。
2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。
相对来说，剪开右心耳更为方便。
我们就是这样做的。
3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。
另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。
4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。
有条件的话可加点肝素。
5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。
先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。
小鼠灌注固定方法：采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。
推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。
大鼠灌注固定取脑
优点：可用单人用注射器直接完成，不用输液管架，而且平均每只仅需5～10ml固定液，时间也仅为5～10min。
注意事项:1)开胸时不要伤到心脏 2)心脏穿刺最好用留置针,软,不宜穿通室间隔,见血即退针芯.插针部位是心尖部,方向向中线.3)生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体.4)多基甲醛固定成功的表现是SD鼠四肢抽搐.5)先断头再一步一步取脑6)根据你实验设计,需要切片的部位,有重点的取,常见的体表标志是前囟和外耳道.7)去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉.
5 灌流：缓慢灌注PBS 10ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛，多聚甲醛的灌流也同PBS。
6 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。
7 取脑：分离除去后颈部肌肉 ，用弯镊小心取出脑组织。
8 后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。
3.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的生理盐水，一瓶底部开口，倒出盐水，倒置灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端
2. 经心脏行灌注固定：麻醉，剪开胸廓，见到搏动的心脏，心尖插入灌注针头，止血钳固定，剪开右心耳，开放静脉血，首先快速滴入生理盐水100－200ml，再注入4%多聚甲醛300-350ml固定液
大鼠灌注固定取脑科研实验
具体方法：
1. 配好4％多聚甲醛PBS缓冲液，配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
11.常用实验动物的给药途径和方法
11.常用实验动物的给药途径和方法第一篇：11.常用实验动物的给药途径和方法常用实验动物的给药途径和方法在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态的变化，常需将药物注入动物体内。
由于实验目的、动物种类、药物剂型不同，给药途径和方法也多种多样。
一经口给药法(一)灌胃法此法给药剂量准确，是借灌胃器将药物直接灌到动物胃内的一种常用给药方法。
1、白鼠灌胃法：抓起小鼠，以左手拇指、食指固定头部，小指、无名指和掌心夹注尾巴，使腹部朝上，颈部拉直，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口角插入口腔，从舌背沿上腭插入食道。
灌胃量0.2～0.5ml/10g。
胃管可用适宜口径的硬质塑料管或磨去针头的8号注射针头弯成适当的弧度制成。
注意，操作时不要用力猛插，以免插破食道或误插入器官造成动物死亡。
2、白鼠灌胃法：左手戴上棉手套，用左手拇指和食指将大鼠头部固定，将大鼠灌胃器沿腭后壁慢慢插入食道。
灌胃针插入时应无阻力，如有阻力或动物挣扎则应退针或将针拔出，重新再插。
灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。
灌胃量10～20ml/kg 3 兔、犬等:灌胃一般要借助于开口器、灌胃管进行。
先将动物固定，再将开口器固定于上下门齿之间，然后将灌胃管(常用导尿管代替)从开口器的小孔插入动物口中，沿咽后壁而进入食道。
插入后应检查灌胃管是否确实插入食道。
可将灌胃管外开口放入盛水的烧杯中，若无气泡产生，表明灌胃管被正确插入胃中，未误入气管。
此时将注射器与灌胃管相连，注入药液。
4、猪的胃内灌注法：给猪下鼻饲管较困难，因猪的鼻翼与上唇联合形成吻突，鼻腔内上下鼻夹与鼻中隔通道极窄，只能通过F10－12号的导尿管，F14号以上的导尿管不能插入，故一般均给猪采用经口入胃的灌胃方法。
具体方法是，预先做好一矩形小木块，中间有一洞，让小猪咬住，将其固定，然后再由此洞下胃管。
此种操作较为简便。
5、鸟类：包括鸽、鸡等，经口灌胃给药，可由助手将其身体用毛巾裹住固定好。
实验者用左手将动物向后拉，使其颈部倾斜，用左拇指和食指将动物嘴撬开，其他三只手指固定好动物头部，右手取带有灌胃针头的注射器，将灌胃针头由动物舌后插入食管。
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的制备
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1（1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；）摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。
②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。
本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。
最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。
③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。
关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal sutureMa Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1(1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious.Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。
大鼠冰冻切片操作方法
大鼠冰冻切片操作方法
【操作步骤】（含溶液配置）
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。
2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。
3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将表面用单面刀片修平。
5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的冷冻台。
待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。
6．调好切片厚度后开始切片。
如果是采用漂片，切片厚度一般20～30μm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板或别的容器。
如果是准备做贴片，片厚一般10μm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。
注意事项：
1.做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。
如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如果贴片那切出来的要多一点。
做免疫组化的话漂片就可以了。
2.液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。
实验一 实验动物给药途径和方法.
实验一实验动物给药途径和方法一、动物的编号、捉拿和固定。
1、动物的编号犬、兔等动物可用特制的号码牌固定于耳。
白色家兔和小动物可用3-5%的黄色苦味酸溶液涂于毛上标号。
如编号1-10号时，将小白鼠背部分前肢、腰部、后肢的左、中、右部共九个区域，从右到左1-9号，第10号不涂黄色(图1-1)如加上其它颜色的染料还可进行1-100号和1-1000号等更多编号。
图1-1 小白鼠背部编号图1-2 小白鼠双手捉持法（引自：医学技能学实验教程. 白波. 2004）（引自：医学技能学实验教程. 白波. 2004）2、动物的捉拿和固定①小鼠：右手抓住其尾，放在实验台上或鼠笼铁纱网上，在其向前爬时，左手拇指及食指沿其背抓住两耳及头颈部皮肤，并以左手的小指和掌部夹住鼠尾固定。
另一抓法是只用手，用食指和拇指抓住鼠尾后再用小指和掌部夹住鼠尾，以拇指及食指捏住其颈部皮肤。
前一种方法易学，后一种方法便于快速捉拿。
（见图1-2，1-3）图1-3 小白鼠双手捉持法（引自：医学技能学实验教程. 白波. 2004）②大鼠：以右手或持夹子夹住尾巴，左手戴上防护手套固定头部防止被咬，应避免用力过大造成大鼠窒息死亡。
根据实验需要麻醉或固定大鼠于鼠笼内或用绳绑其四肢固定于大鼠手术板上。
③豚鼠：以右手抓住豚鼠头颈部，将其两前肢在豚鼠头与右手拇指与食指之间，轻轻扣住颈胸部，右手抓住两后肢(对体重较大的豚鼠则可托起其臀部)，使腹部向上。
④兔：用手抓起兔脊背近后颈部皮肤，手抓面积应尽量大些。
以另一手托起兔的臀部。
将兔仰卧固定时，一手抓住颈部皮肤，另一只手顺着腹部抚摸至膝关节处压住关节。
另一人将绳子用活结捆绑兔的四肢，使兔腹部向上固定在兔手术台上。
头部则用兔头固定夹固定，也可用棉线将兔的门牙固定于兔手术台上的柱子上，后者更常用(图1-4)。
图1-4 家兔捉持法（引自：医学技能学实验教程. 白波. 2004）二、实验动物的去毛动物去毛是手术野的皮肤准备之一。
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。
2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3.不可用于western blot和PCR。
4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。
多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。
Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。
用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。
若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。
2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3.不可用于western blot和PCR。
4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。
多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。
Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。
用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。
若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。
注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。
[医学]大鼠灌注固定取脑,解剖取材
![[医学]大鼠灌注固定取脑,解剖取材](https://img.taocdn.com/s3/m/3cb4fdc019e8b8f67c1cb958.png)
• 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。
• 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。
• 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯 • 剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断 • 膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏， • 直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。
• 5.关于生理盐水的温度的选择，有人认为因 为是快速冲刷血管里的血液，低温造成血 管收缩，灌注的效果反而没有室温的好。 但是用低温的认为，低温有利于组织完整。
• 6.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈 抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成 一直线；所灌注的脑组织白而硬。
• 7.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。
省时省剂的方法
夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定 的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水 约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白即可 改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即 可。
灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧 烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完 全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组 织白而硬
从小脑处将脑组织向上推起，用小 剪刀剪断脑神经
注意事项 • 1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。 • 2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑
突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成 人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉 剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。
生理盐水冲洗
4%多基甲醛固定
取脑
保存或切片.
具体过程
大鼠经深度麻醉后胸暴露并游离出心脏,经 左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌 注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺 脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注 冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲 醛浸泡固定24小时。
两种不同ttc染色方法对于大鼠心肌缺血再灌注损伤中国实验动物学报
(大鼠心肌缺血再灌注两种不同TTC染色方法的比较李粮辉1，陈文华1，郑宏2（1.福建医科大学附属协和医院麻醉科，福州，350001；2.南京军区福州总医院麻醉科，福州，350025）【摘要】目的：比较应用不同2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法对大鼠心肌缺血再灌注损伤后梗死面积的检测效果。
方法：将20只SD大鼠(雄性、8周龄，体重250～300g)按随机数字表法分为两组，每组10只，A组：传统TTC 染色法组，B组：改进后的TTC染色法组，分别进行大鼠心肌染色,随后计算心肌梗死面积及测定血清cTnI浓度水平。
结果：A组和B组均能较好地标记梗死心肌;A组和B组心肌梗死面积百分比无统计学差异（48.69±5.37 % VS 47.41±3.28%，P>0.05）；A组和B组血清cTnI浓度水平无统计学差异（4.51±0.88ng/ml VS 4.70±0.71ng/ml，P>0.05）；但B组心肌切片染色色泽对比度及心肌非梗死区与梗死区区分度均高于A组。
结论：改进后的心肌TTC 染色法采用在体染色，不仅操作简便，节省了实验时间和经费，而且提高了染色效果，能更准确地反映心肌缺血再灌注损伤的程度。
因此改进后的心肌TTC染色法是一种经济、简便、快捷、高效的染色方法。
【关键词】缺血再灌注;心肌梗死面积;2，3，5-氯化三苯基四氮唑;染色A Comparison of Two Different TTC Staining Methods for Ischemia- reperfusion Myocardium in RatsLI Liang-hui1，CHEN Wen-hua1， ZHENG Hong2(1. Department of Anesthesiology,Fujian medicine university affiliated xiehe hospital ,Fuzhou 350001, China;Department of Anesthesiology,Fuzhou general hospital of Nanjing military command,Fuzhou 350025,China)【Abstract】Objective To compare the different TTC staining methods of measuring myocardial infarct size after ischemia-reperfusion in rats. Methods 20 Rats were randomly divided into two groups including group A with traditional TTC dyeing method and group B with the modified TTC作者简介：李粮辉(1990-)，女，硕士，研究方向：心肌保护，E-mail:huixiaoyi68@163通讯陈文华，男，教授、研究生导师，E-mail:whc6202@163dyeing method for ischemia-reperfusion myocardium ,then infract size was caculated and the levels of their serum cTnI were determined. Results Both group A and group B detected the infarcted myocardium well;there were no significant difference in the myocardial infarct size between groupA and group B（48.69±5.37 % VS 47.41±3.28%，P>0.05）; there were no significant difference in the levels of serum cTnI between group A and group B（4.51±0.88ng/ml VS 4.70±0.71ng/ml，P>0.05）;but compare with A ,the colour contrast of dyed myocardial slice and the differentiation of infarction area and non-infarction area were much clearer in group B. Conclusions The modified TTC dyeing method using In vivo staining is a kind of economic, convenient, fast and efficient method with being easy to control ,saving experimental time and expense, improving the dyeing effects ,evaluating the size of myocardial ischemia/reperfusion injury more accurately.【Key words】 ischemia/reperfusion ； myocardial infarct size ；2,3,5 -triphenyltetrazolium chloride ；staining心肌缺血再灌注损伤是近十几年来医学界研究的热点之一,其重要的病理特征之一是出现心肌梗死区。
动脉留置针在大鼠体脑组织灌注中的应用
动脉留置针在大鼠体脑组织灌注中的应用目的：拟寻求一种更好的大鼠体脑组织灌注方法以提高灌注固定效果。
方法：健康雄性SD大鼠经10%水合氯醛进行麻醉，暴露心脏和主动脉弓，以小动脉夹夹闭胸主动脉，用动脉留置针在大鼠心尖波动最明显处进针，进入约0.5 cm 时，边退出针芯，边将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部，并关闭套管针尾端的开关，防止血液外溢，连接输液管，剪破右心耳，依次从心脏灌注0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛固定脑组织。
结果：脑组织灌注所需的灌注液减少，灌注插管时间及总灌注时间均缩短，且灌注后脑组织更硬、色泽更白。
结论：采用此种灌注方法后，其灌注固定效果明显提高，且操作过程简单易行，值得推广。
免疫组化等病理学实验研究中，为避免脑组织细胞的变形及自溶现象，动物处死前需行灌注固定处理[1-2]，故动物在体脑组织的灌注固定效果对试验结果尤为重要。
就脑组织灌注固定方面，报道的文献不少，有经心脏灌注、颈总动脉灌注、经股动脉灌注等方法；灌注过程中有夹闭腹主动脉、胸主动脉等；灌注针有用静脉输液器针、自制灌流针（去掉输液器针头的针尖或12-16号针头上套一长约1.5 cm的塑料管并将塑料管前端剪成针尖状）和普通针头等。
对此，为寻求一种操作简单易行且灌注固定效果好的方法，笔者在大鼠体脑组织的灌注固定实验过程中，采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法，现将实验操作过程的体会介绍如下。
1 材料与方法1.1 试剂和器械BD动脉留置针（货号：REF682245，规格型号：20 G、1.10 mm×45 mm、49 mL/min），见图1，4%多聚甲醛新鲜配置（天津市光复精细化工研究所），0.9%复方氯化钠注射液（500 mL/4.5 g、宁夏启元药业），10%水合氯醛（成都金山化学试剂有限公司），三通（舒尔康、批号：120225）、止血钳、组织剪、眼科剪、小动脉夹、皮镊、输液管（2副）等。
图1 BD动脉留置针1.2 实验动物选取体重450～500 g，健康雄性18个月龄SD大鼠24只[购于宁夏医科大学动物实验中心，清洁级，合格证号：SCXK（宁）2011-0001]，常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食。
实习技能学习大全
一、技能腹腔注射：注意手势。
三指抓住背部皮肤，注意让小鼠的头部向下，让腹腔中的器官倒向胸部，避免注射器损伤大肠、小肠。
体型较小的小鼠可以采用z型进针，避免漏液。
滴鼻：鼻炎造模：适应性培养7天基础致敏：隔天一次，注射卵清蛋白+佐剂。
七次加强致敏：卵清蛋白滴鼻，7次搔鼻、喷嚷、鼻溢症状叠加量化计分。
总分25分以上造模成功分组：空白组、模型组、西药对照组、穴位贴敷组、阻断剂加穴位贴敷组、穴位激动剂组大鼠福尔马林灌注：（1）在手术之前，腹腔注射麻醉剂进行麻醉。
（3）做一腹壁切口，分离肝脏和横膈。
使用钝头剪刀在横膈上做一个小切口，形成气胸。
（4）切割肋骨至锁骨，暴露心脏。
钝性分离心脏周围组织，将灌注针从心尖部位扎入左心室，尖端进入升主动脉后使用止血钳固定。
（5）剪开右心耳，开始灌注。
一只大鼠的灌注时间大约为30-60min，灌注成功后应见到：刚开始时，大鼠四肢剧烈抽搐，眼部和肝脏颜色逐渐变白，灌注完成后四肢和颈部僵硬。
二、统计学Image j，prism，统计学的选择组内比较选择配对样本t检验无明显差异，说明可比性。
方差分析需要满足的条件是正态分布和方差齐性（不齐可以选择登尼特检验），不符合正态分布可以选择秩和检验。
独立性组间比较选用的是单因素方差分析，事后检验选择的最小显著差异法lsdImage j要求：亮度，一次拍完，足够白色，空白组灰度值最好达到230灰度（空白255）-光密度（空白为0）平均光密度，微积分三、医学科普碘伏泡脚可以治疗脚气吗碘伏，消毒，可以抑制真菌康唑软膏四、如何开展一次实验五、中医科研相关六、过敏性鼻炎诊断标准七、免疫组化、跑蛋白、elisa、pcr八、亚健康、高尿酸肾病1、为啥没过六级，四级在刚入大学的时候没有充分意识到英语的重要性，也没有掌握好英语学习的技巧和方法，所以在四级考试和六级考试时候显得很吃力。
在考研阶段，对英语的复习中逐渐掌握英语的学习方法，也取得了相对较好的英语阅读能力。
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑用途：1。
用于常规HE染色，免疫组化分析.2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3。
不可用于western blot和PCR.4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法.多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留,脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后,取脑操作时,可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP）：流程：1)麻醉2）开胸3）心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5）4％多基甲醛固定6)取脑7）保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃）XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，后再灌注冰冻（4℃)4％多聚甲醛XmL,断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时。
Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液.用1.0mol/L的NaOH 值至7。
4,使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。
简便方法:先配好PBS，称好相应的多聚甲醛,37℃水浴或温箱密封放置2天,就能全溶。
若是很急,55℃水浴一天，期间不时震荡。
注意，4％的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质，避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。
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大、小鼠灌注固定的方法
准备物品：
1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺）
2、医用输液器
3、500ml输液用玻璃瓶
4、血管钳
5、剪刀
6、生理盐水
7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制
大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。
左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。
取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。
多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。
如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。
如此灌注约需1小时时间。
充分暴露升主动脉
套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉
1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。
2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。
相对来说，剪开右心耳更为方便。
我们就是这样做的。
3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。
另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。
4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。
有条件的话可加点肝素。
5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。
先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。
小鼠灌注固定方法：
采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20
mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20
mL 生理盐水。
推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。