无机及分析化学第9章-高效液相色谱法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
二、方法原理
1.分配色谱法 是利用待测物在互不相溶的两相中分离系数 的不同使组分分离的一种方法。其中一相被涂布或健合在固 体载体上(固定相),另一相为液体或气体(流动相)。
正相色谱 反相色谱 2.离子交换色谱法 是利用离子交换原理和液相色谱技术相
结合,测定各类阴、阳离子的分离分析方法。 原理:利用不同待测离子对固定相的亲和能力(或离子交换
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成,其中高压输 液泵是核心部件。
(1)贮液器 用来贮存流动相,其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
(2)过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤,一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外,在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
4. γ-666;5. 恩氏剂。
二、主要部件及功能
通用型检测器,又称总体性质检测器,其响应值取决于 流出物(包括试样和流动相)总的物理或物理化学性质 的变化。
专用型检测器,又称溶质性质检测器,其响应值取决于 流动相中被分离组分的物理或物理化学性质。
5.数据处理系统 HPLC通常配备有记录仪、积分仪或色 谱工作站等,以完成对检测信号的记录、处理和控制等 。
二、主要部件及功能
(3)高压输液泵 一个好的高压输液泵应符合下列要求:① 密封性好,耐腐
蚀;② 有足够的输出压力,使流动相能顺利通过色谱柱;③ 输出压力平稳,脉冲小;④ 输出流量恒定,可调范围宽;⑤ 泵室体积小(<0.5 mL),易于清洗,便于迅速更换溶剂。 (4)梯度洗脱装置 利用两种或两种以上的溶剂,按照一定的 时间程序连续或阶段地改变溶剂的比例,从而改变流动相的极 性、离子强度或pH值等,从而提高试样的分离效率,缩短分析 时间,使色谱峰形得到改善,提高测定的灵敏度和定量的准确 度。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9-3中。
图9-3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
(一)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球,在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
敏度高、重复性好、定量精度高、操作自动化、应用范围广等
优点。适用于分析高沸点、强极性、热稳定性差的化合物。缺
点是:价格昂贵,要用各种填料柱,容量小,分析生物大分子 和无机离子困难,流动相消耗大且有毒性的居多。
二、方法原理
现在的色谱法已不局限于色素的分离,其方法也已经得到了 极大的发展,但其分离的原理仍然是一样的:利用欲分离的诸组 分在固定相和流动相间的分配有差异(即有不同的分配系数) ,当两相作相对运动时,这些组分在此两相中的分配反复进行 ,从几千次到百万次,即使组分的分配系数只有微小差异,随 着液体流动相移动却可以有明显的差距,最后使这些组分都得 到分离。
二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理:于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨(称 为间隔臂),然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时,其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留,无此作用的则被淋洗出;随后 ,改变流动相pH或组成,再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
的选择性。 (2)溶剂与检测器匹配。 (3)高纯度。 (4)化学稳定性好。 (5)低粘度 2.对流动相的选择
三、HPLC法应用实例
高效液相色谱法适宜于分离、分析高沸点、热稳
定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质,因
而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物
、药物、人体代谢产物、表面活性剂,抗氧化剂、杀 虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。
能力)的差别来实现分离的。
二、方法原理
3. 离子色谱法 离子色谱(IC)是20世纪70年代发展的新 方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样,只是流出的各 种离子用电导检测器检测。
4.分子排阻色谱法(又称凝胶色谱) 主要用于大分子的分子 分离。
原理:固定相为化学惰性的多孔凝胶,它类似于分子筛,但 孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴,分子体积大的待测物 不能渗入孔穴中而被排阻,较早地被淋洗出来,中等的部分 渗透,小分子则完全渗透,最后流出色谱柱。
一、组成与结构
高效液相色谱仪
的结构主要由高压输
液系统、进样系统、
分离系统和检测系统
四部分组成。此外,
还配有辅助装置如梯
度淋洗,自动进样及
数据处理等。
工作流程如结构示意 图9-1:
贮液瓶
脱气装置
高压泵 梯度装置
流量控制
控温
进样装置
记录器
数据处理
检测器
分离柱
废液
图9-1 高效液相色谱仪的结构示意图
二、主要部件及功能
第九章 高效液相色谱法
§1-1 概述 §1-1 高效液相色谱仪 §1-1 高效液相色谱法的应用
本章学习目标
【知识目标】
掌握高效液相色谱仪的工作流程; 熟悉高效液相色谱的固定相和流动相及高效液相色谱法的点; 了解液相色谱的分离原理和液相色谱的基本类型。
【能力目标】
学会高压泵和梯度洗脱技术; 能够操作高效液相色谱仪。
一、色谱法简介
色谱法是1903年俄国植物学家茨维特(Michael Tswett) 应用吸附原理分离植物色素的方法。
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代讯速发展起来的
一项高效、快速的分离技术。他是在经典的液体柱色谱的基础
上,引入了气相色谱法的理论,在技术上采用了高压泵、高效
固定相和高灵敏度检测器,实现了分析速度快、分离效率和灵
例1 有机氯农药的测定,采用液-固色谱法。
色谱条件:50cm×2.5mm(内径)色谱柱;
三、HPLC法应用实例
流动相:正己烷; 固定相:薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m);
流速:1.5ml/min
检测器:示差折光
色谱图:如图9-4 。
图9-4 有机氯农药的HPLC分析 1. 艾氏剂;2. p,p’-DDT; 3. p,p’-DDD;
二、主要部件及功能
3.分离系统 分离系统包括色谱柱、柱温箱及连接管等。 色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件,色谱柱由柱管和固定
相组成。色谱柱分为分析型和制备型两类。 4.检测系统 关键部件是检测器。检测器的作用是将柱流出物
中样品组成和含量的变化转变为可供检测的信号。高效液相 色谱仪按其应用范围可分为通用型和专用型两大类。
2. 全多孔型固定相
二、固定相和流动相的选择
3.固定相的选择
(1)要求固定相粒度(dp)小、筛分范围窄、填充
均匀,以减小涡流扩散和动态流动相传质阻力。 (2)选用浅孔道的表面多孔型载体或粒度小的全多孔
型载体,以减少静态流动相传质阻力和固定相的传质 阻力。
二、固定相和流动相的选择
(二)流动相 1.对流动相的要求 (1)溶剂对于待测样品,必须具有合适的极性和良好
二、主要部件及功能
2.进样系统 是将样品溶液导入色谱柱的装置。在来自百度文库效液相色谱法 中,对进样装置的要求是具有良好的密封性和重复性,死体积小。 常用的进样方式有注射器进样和六通阀进样两种。目前普遍采用是
六通阀进样。如图9-2所示。
泵 泵
柱 柱
排放 进样
排放 进样
图9-2 六通阀采样和进样示意图