微生物育种技术研究进展

微生物育种技术研究进展摘要：生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。

微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。

但是有时候微生物育种也不是单一的一种方法，有的是需要多种方法综合使用。

本文将各种微生物育种技术进行总结和细致分析。

关键词：微生物育种；诱变育种；基因重组育种；基因工程育种1.常规育种常规育种是以不经过人工处理，利用微生物自发突变为基础，从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方法一般情况下，由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，发生自然突变的几率特别低，一般为106～1010/BP，而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制，所以常规育种时间较长，工作量较大。

，通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。

因此在生产实践中，常规育种的主要目的是用来纯化、复壮、稳定菌种。

2. 诱变育种1927年MILLER发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后人们发现其他一些因素也能诱导基因突变，并逐渐弄清了一些诱变因素的机理，为微生物诱变育种提供了前提条件根据育种需要，有目的地使用诱变因素，可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状.凡能诱发基因突变，并且突变频率远远超过自发突变的物理因子或化学物质被称为诱变剂。

根据诱变剂的不同可以将诱变育种的方法分为：有物理因子诱变育种和化学因子诱变育种。

，前者包括激光、X-射线、"r-射线、快中子等)后者主要是烷化剂（包括EMS、EI、NMU、DES、MNNG、NTG等），天然碱基类似物，亚硝酸和氯化锂在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性,化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎.目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂，以达到预期的育种效果. 2.1物理因子诱变2.1.1 UV所有传统的物理诱变手段中，使用得最为普遍的就是紫外线辐照，它是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。

对于紫外线的的作用有很多解释，但研究最清楚的是它可引起DNA结构的变化，尤其是可使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体的出现会减弱氢键的作用，引起双键结构变形，就可能影响胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的正常配对，破坏了腺嘌呤的正常掺人，复制就在这一点上突然停止或错误地进行。

如果错误地进行复制，且在新形成的链上有一个改变了的碱基次序，则在随后的复制过程中，碱基次序已改变的DNA链照常进行复制，产生了一个在两条链上碱基次序都是错误的分子而引起突变归J。

利用紫外诱变的方法可选育出大量产量高，活性强的菌种，由于其设备简单，诱变效率高，操作安全而被广泛应用。

白兰芳等用紫外线单因子处理、光复活处理西罗莫司产生菌Streptomyces hygro—scopicus得到了一正变株UV-8-61，效价比出发菌株提高了2—3倍。

近些年来紫外线作为一种基本的诱变因子，也常常和其他一些诱变因子联合作用于微生物而提高诱变效果。

胡永兰等用UV和DES(硫酸二乙酯)复合处理梧宁霉素产生菌，得到一株较高的突变株，效价比出发菌株提高291．72％。

2.1.2 微波2.1.2.1微波诱变育种的原理微波作为一种高能电磁波，能刺激水、蛋白质、核酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。

在2450MHz频率作用下，水分子能在1s内180°来回震动24.5*108这种震动引起摩擦，因此可以使得单孢子悬液内DNA分子强烈摩擦，孢内DNA分子氢键和碱基堆积力受损，使得DNA结构发生变化，从而引发遗传变异。

2.1.2.2微波诱变育种的一般操作方法微波育种现在研究的很多，成功的例子也很多。

它操作方便，设备简单，一般用家用微波炉，诱变的效果很好。

下面以宇佐美曲霉为例，简要介绍一下微波进行微生物育种的一般操作方法。

（1）孢子最液的制备取恒温箱内30℃下培养4d的菌种斜面，用0．85％的生理盐水洗下孢子，置于无菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在210r／rnin的旋转式摇床上振荡5h，使孢子活化和分散，然后用生理盐水将孢子悬液稀释到106个／mL，得孢子悬液备用。

（2）微波诱变吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调微波炉功率为700w，脉冲频率为2450比，按不通的处理时间(一般小于1m洫)，对孢子悬渡进行辐照处理。

然后分别从每个平皿中取出0．1mL的菌悬液，进行适当稀释，得到不同稀释度的菌悬液。

（3）筛选菌悬液O．3mL，涂布分离培养基平板。

然后置于30℃恒温箱培养3d。

话菌计数，计算致死率。

以分离平板上透明圈直径和菌落直径的比值作为初筛标志，挑取比值大的菌落在斜面上传代3次，然后进行摇瓶发酵复筛。

2.1.3激光激光激光是一种光量子流，又称光微粒。

自从Mester于1968年提出小剂量辐射对生物有刺激效应的研究理论后，激光应用于生物学领域的成就备受人们的关注。

激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接地影响生物有机体。

引起DNA、染色体畸变效应，酶的激活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等。

光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。

杨素红等曾用20mWHe —Ne激光照射棉病囊霉引起突变，使不产核黄素的原始野生型菌株产生核黄素；陈有为等对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)As2．1 189进行C02激光诱变育种，发现对酵母菌乙醇代谢的改变有刺激效应。

目前激光成为微生物的常用诱变剂。

不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同。

赵炎生等u列比较紫外、He—Ne激光，Nd：YAG倍频脉冲激光对脱落酸产生菌的诱变效果，其中He．Ne激光诱变正变率为5.6％；Nd：YAG倍频脉冲激光诱变正变率为19．6％；Nd：YAG倍频脉冲激光诱变辐照次数400次时效果较好，所得的高产菌株效价提高率可达60％以上。

2.1.4太空射线和磁场太空射线和磁场空间环境具有强辐射、微重力、高洁净、高真空等特点，有诱发突变的因素。

我国开展863高技术航天领域空间诱变育种的研究，取得了很好的成绩|。

在空间生命科学领域中，微重力和宇宙射线的生物学效应，是最重要的，宇宙射线作用于生物体的最直接效应是引起生物体内发生电离，产生许多次高能电子和自由基，自由基对生物大分子造成损伤，使生物产生变异病变，组织损伤致死等效应.贾士芳等把枯草芽孢杆菌314菌株——超氧化物歧化酶(SOD)产生菌经我国“92106”科学返回式卫星搭载之后，酶活性提高2倍多，而且生长速度加快。

王璋等¨刮将生产微生物谷氨酰胺酶(MTG)链霉菌WZFE．L．M1的孢子和斜面培养菌体搭载“神舟”四号无人飞船，搭载菌株的菌落形态发生变异，并获得一系列产酶能力大幅度提高的优良突变菌株。

产酶能力提高了30％以上，能够稳定发酵生产高于3．5U／ml的MTG，集中体现了航天飞船搭载的空间诱变育种技术效果。

2.1.5低能离子束离子注入是20世纪80年代初兴起的一种材料表面处理的高新技术，主要应用于金属材料表面的改性。

1986年被用于农作物育种，现在逐渐应用于多种农作物。

所谓离子注入诱变，就是利用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状的变异，从而达到育种的目的。

2.1.5.1低能离子束育种机理借助于低能离子注入技术使生物体的特征特性发生本质变化，进而对生物体进行遗传改良是离子束生物技术的主导思想，离子生物技术是将能量为几万至几十万伏的离子束射人生物体内，在离子束的能量、质量和电荷三因素作用下，使基因产生突变，再从这些变异的种子中选出优良变异种质，经过培育而成为新品种。

因此，能量、质量、电荷成为离子束生物技术作用的核心，能量沉积效应‘2一副、质量沉积效应，电荷交换效应是目前离子束生物技术的主要理论依据。

其中，能量沉积指注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物大分子逐步获得能量进而发生键断裂、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程；质量沉积指注入的离子与生物大分子形成新的分子f动量传递会在分子中产生级联损伤I电荷交换会引起生物分子电子转移造成损伤，从而使生物体产生死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。

2.1.5.2离子束育种的优点离子束诱变的主要优点表现在：一是变异频率高，可选择注入的离子种类多样，而且其质量、能量、电荷可有多种组合，所以其产生的诱变结果和效应也是多种多样的。

二是变异谱宽，离子柬的LET(传能线密度)大于丫射线和中子，能产生较高的电离密度，使DNA产生严重损伤，其作用于植物体后可获得较高的突变频率和较广的突变谱，易于筛选出新的突变体。

三是变异稳定快，离子注入造成的损伤不易修复，突变体稳定较快。

四是技术稳定可靠，简单易得，在电场、磁场的作用下被加速或减速以获得不同的能量，而且可对其进行高精度的控制，从而可获得平行柬，也可被聚焦成微细束，在固体内的直进性好；经加速后的离子具有一定的静止质量，注人生物体后可以使质量、能量和电荷共同作用于生物体。

因此离子束生物技术将成为生物培养与改良中的一种非常重要的手段之一。

2.1.5.3离子束注入微生物的育种方法离子注入装置—离子注入机：离子注入机由离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统和靶室组成，可以根据实际需要省去次要部位。

离子源是离子注入机的主要部件，作用是把需要注入的元素电离成离子，决定着注入离子的种类和束流强度。

中科院等离子体物理研究的一台小型的ECR（Electron Cyclotron Resonance）离子源装置由离子源、分子泵、进气口、真空室、感应圈、靶室和束流积分仪七部分构成。

具有壁溅射低、离化率高、工作寿命长、能获得高密度氧化性离子流和注入剂量测定精确等特点。

离子源的直流放电或高频放电产生的电子作为轰击粒子，当外来电子的能量高于原子的电离电位时，通过碰撞使元素发生电离，碰撞后除原始电子外，还出现正离子和二次电子。

正离子进入质量分析器选出需要的离子，再经加速器获得较高的能量（或先加速后分选），由四极透镜聚焦后进入靶室，进行离子注入。

另外，离子束能量、金属束流、气体束流和束斑等的工作量范围因注入机的不同而有差异。