第二章基因工程制药part3
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《基因工程制药》PPT课件
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21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
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22
第一个合成蛋白质的国家。
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10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
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8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
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结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
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11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
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12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
基因工程制药技术 基因工程操作流程
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式转导（transduction）通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式显微注射通过微量注射器将重组DNA直接注入受体细胞中基因枪
基因枪
显微注射
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法标志补救（marker rescue）若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因（reportor gene），常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接1、连接工具T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶2、连接方式粘性末端连接（1）同一限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式粘性末端连接（2）不同限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式平末端连接适用于限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌1、受体细胞是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）种类微生物受体细胞（原核、真核） 植物受体细胞动物受体细胞
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式显微注射通过微量注射器将重组DNA直接注入受体细胞中基因枪
基因枪
显微注射
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法标志补救（marker rescue）若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因（reportor gene），常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接1、连接工具T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶2、连接方式粘性末端连接（1）同一限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式粘性末端连接（2）不同限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式平末端连接适用于限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌1、受体细胞是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）种类微生物受体细胞（原核、真核） 植物受体细胞动物受体细胞
Part2 基因工程操作工具
基因工程制药
Filtration Bacteria Free
Identification Semi-manufactured Goods
Identification Finished Products
Make up or Packaging
1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：
制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的核 酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连 接等分子克隆操作。
主要包括: 工程菌大规模发酵最佳参数的确立 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 计算机的优化控制等。
基因工程技术生产药品的优点
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性 多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的 保障；
b. 可以提供足够数量的生理活性物质， 以便对其生理生化和结构进行深入的研 究，从而扩大这些物质的应用范围；
基因工程技术生产药品的优点
c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘 更多的内源性生理活性物质；
（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、 确定基因 的 转录方向、转录起始点等。）
基因工程技术的应用特点：
A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内 分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、 新型药物和新型诊断试剂。
B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端 复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在 体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当 的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、 数千倍的相应的蛋白质。
逆转录法
2、cDNA第一链的合成：寡聚脱氧胸苷酸为引物，逆转录
酶催化，合成互补DNA。
第二章 基因工程制药
• 探寻具治疗作用的新基因备用基因工程药 物
• 我国基因工程药物研究和开发：起步较晚，基础较差。 α 1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有 国际先进水平的生物高科技成果，于1997年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计 划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。 目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研 究开发中的也有10余种。
同裂酶（Isoschizomers)
• 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 Ⅰ. 完全同裂酶：
– 识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ和Hsu I
Ⅱ. 不完全同裂酶：
– 识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和Sma
同尾酶（Isocaudamers)
8、限制性内切酶对DNA的消化
• 内切酶与识别序列的结合模式
（4）短时间培养转化 细胞，以扩增 DNA重 组分子或使其整合到 受体细胞 的基因组中 （简称“增”）；
（5）筛选和鉴定转 化细胞，获得使外 源基因高效表达的 基因工程菌或细胞 （简称“检”）；
基因工程关键要素
• • • • 工具酶与载体系统 目的基因的获得 基因的重组与转移 克隆基因导入宿主细胞表达
连接反应的机理
连接反应的温度
• 连接酶反应的最佳温度37 ℃。但在37℃ 下 粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 14 ～16 ℃。
影响连接反应的因素
1. 插入片段与载体的浓度比例： 10~20倍。
– 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自 我连接的现象。
2. 反应温度：一般14~16℃
（三）DNA聚合酶
第二节
基因工程的工具酶与载体
一、工具酶
• 常用的工具酶：
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
第二章-基因工程制药_PPT幻灯片
传统生物药物由于来源及制备上的困难、价 格等因素的影响，此外在制备过程可能受到 的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工 程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的 优势。
应用基因工程技术可十分方便且有效地解决 上述提到的问题，从量、质上都可以得到改 进，且可以创造的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体 内能表达产生所要蛋白产物。
生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于 细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA 分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所 需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出 40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的 基因的方法是人工合成，即基因模版合成。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒
构建基因工程 菌或细胞
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成；
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2、cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为 引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP；在 凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小， 探索最佳反应条件。
3、cDNA第二链的合成
先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交 链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二 链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形 结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此 反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性 切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结 构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖 凝胶电泳进行测定。
第二章基因工程制药新版3
第二章基因工程制药新版3
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
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决定工艺采用的温度及流程时间
影响产物的回收
第二章基因工程制药part3
• 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法
方法
目的
离心/过滤
去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒
40nnm微孔膜过滤 进一步去除病毒
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤
去除沉淀物及病毒
第二章基因工程制药part3
•包含体的分离、溶解和复性
•细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆） •固-液相分离（离心）
•去污剂或/和低浓度尿素或盐酸胍洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白
•高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇) •打开二硫键
•逐步透析或稀释去除变性剂
第二章基因工程制药part3
• 素几方式等； • ⑷ 初始物料的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主
要 • 杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、
流 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
2. 物料中杂质种类和性质
•
物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电
荷性
• 质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥
•
非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。
• ⑶ 固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和Βιβλιοθήκη 膜•过滤。
第二章基因工程制药part3
• 2. 目的产物的分离纯化
• 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术 分
• 为： • Ion exchange chromatography （IEC） • Reversed phase chromatography （PRC） • Hydrophobic interaction chromatography （HIC） • Affinity chromatography （AC）
骤，或干扰产品质量；
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑸ 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性 差的产物；
• ⑹ 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件 要求低，能耗低；
• ⑺ 具有较高的安全性
第二章基因工程制药part3
• 针对不同的产物表达形式采用不同的策略
组织培养细 胞
细菌、酵母
高压匀浆 研磨
高速珠磨
细菌、酵母、 植物细胞
细菌、植物 细胞
细胞混悬液
低渗裂解 冻融裂解
红细胞、 细菌
培养细胞
第二章基因工程制药part3
三．分离纯化的技术
• 分离纯化技术要求：
• ⑴ 技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； • ⑵ 选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物
物和
5. 副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、
6. 胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降
解
7. 产物的酶类等；
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
• ⑶ 生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连 续
• 、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件 因
第二章基因工程制药 part3
2020/12/10
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特 1. 点目的：产物在初始原料中的含量较低；
2. 含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还 有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。
透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓 度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响 复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。 对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺 （cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨 试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。 复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可 能是由于增加了复性中间体的可溶性。 复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。 通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在亲和层析柱上复性）。
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进
行
• 分离的；
•
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行
分
• 离的；
•
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离
于
• 一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大
的
第二章基因工程制药part3
• 多种分离纯化技术的联合运用
第二章基因工程制药part3
避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，
如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。
使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，
如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）
和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴
•
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规
模产
• 业化过程未必合适，如：
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产
工
艺
第二章基因工程制药part3
• 包含体的形成：
• 原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所 形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的 内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大 肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键 的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间 有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含 体的产生有利有弊。
分离出来，达到较高纯化倍数； • ⑶ 收率要高； • ⑷ 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或
调整，这样可减少工艺步骤； • ⑸ 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
第二章基因工程制药part3
• 1. 细胞破碎与固液分离
• ⑴ 细胞收集：离心和膜过滤
• ⑵ 细胞破碎：
•
机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。
第二章基因工程制药part3
•一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。 一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间 的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋 白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止 聚集，是提高复性收率的关键。
离子交换 分辨率通常较高；流速较快 最适于早期纯化，即大体积 （合适的填料）；容量很大， 样品且蛋白纯度较低时使用 样品体积不受限
发性
• 、吸附性能等。
3. 目的产物特性
4. 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对 分
5. 子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
4. 产品质量的要求
5. 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的 要
6. 求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种 类
疏水层析
去除残余的杂蛋白
凝胶过滤
与多聚体分离
0.22μm微孔膜过滤 除菌
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑴ 具有良好的稳定性和重复性； • ⑵ 尽可能减少组成工艺的步骤； • ⑶ 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，
工艺和设备相适应。 • ⑷ 在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步
侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的
正确折叠。
过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌
周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催
化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。
在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正
确的折叠蛋白。
第二章基因工程制药part3
第二章基因工程制药part3
• 产物的主要特性及在分离纯化中的作用
产物特征
作用
等电点 疏水性 特殊反应性 聚合性 生物特异性 溶解性 稳定性 微不均一性
决定离子交换的种类及条件
与疏水、反相介质结合的程度
产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制
是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体
决定亲和配基
决定分离提系及蛋白浓度
•
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种
技
• 术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
第二章基因工程制药part3
• 分离纯化过程的规模化
7. 和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存 稳
8. 定性等。
第二章基因工程制药part3
二．分离纯化的基本过程
• 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细 胞
• 生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 • 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，
包
• 括 细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高 度
分离原理
分子大小
电荷 等电点 疏水特性
生物亲和性
常用的蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术