第二章基因工程制药part3
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第二章基因工程制药part3
•一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。 一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间 的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋 白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止 聚集，是提高复性收率的关键。
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进
行
• 分离的；
•
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行
分
• 离的；
•
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离
于
• 一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大
的
第二章基因工程制药part3
• 多种分离纯化技术的联合运用
• 素几方式等； • ⑷ 初始物料的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主
要 • 杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、
流 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
2. 物料中杂质种类和性质
•
物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电
荷性
• 质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥
物和
5. 副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、
6. 胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降
解
7. 产物的酶类等；
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
• ⑶ 生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连 续
• 、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件 因
• 纯化直至得到纯化以及成品加工。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物分离纯化的一般流程
第二章基因工程制药part3
•各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法 旋刀式均浆
手动式匀浆
超声破碎
组织种类 大多数动、 植物组织 柔软的动物
组织 细胞浑浊液
细胞破碎方法 组织种类
酶溶
细菌、酵母
去垢剂渗透 有机溶剂渗透
侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的
正确折叠。
过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌
周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催
化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。
在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正
确的折叠蛋白。
第二章基因工程制药part3
第二章基因工程制药 part3
2020/12/10
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特 1. 点目的：产物在初始原料中的含量较低；
2. 含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还 有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。
第二章基因工程制药part3
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
等电点处于极端区域（pI≦5或 pI≧8）的重组蛋白
应
• 首选离子交换法进行分离，这样很容易除去所有的杂蛋
白
•；
•
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是
首
• 选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋
白
• 之间的解离常数应在合适的范围内（10-8~10-4 mol/L）； 第二章基因工程制药part3
•
非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。
• ⑶ 固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和
膜
•
过滤。
第二章基因工程制药part3
• 2. 目的产物的分离纯化
• 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术 分
• 为： • Ion exchange chromatography （IEC） • Reversed phase chromatography （PRC） • Hydrophobic interaction chromatography （HIC） • Affinity chromatography （AC）
第二章基因工程制药part3
•包含体的分离、溶解和复性
•细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆） •固-液相分离（离心）
•去污剂或/和低浓度尿素或盐酸源自文库洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白
•高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇) •打开二硫键
•逐步透析或稀释去除变性剂
第二章基因工程制药part3
疏水层析
去除残余的杂蛋白
凝胶过滤
与多聚体分离
0.22μm微孔膜过滤 除菌
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑴ 具有良好的稳定性和重复性； • ⑵ 尽可能减少组成工艺的步骤； • ⑶ 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，
工艺和设备相适应。 • ⑷ 在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步
第二章基因工程制药part3
• 产物的主要特性及在分离纯化中的作用
产物特征
作用
等电点 疏水性 特殊反应性 聚合性 生物特异性 溶解性 稳定性 微不均一性
决定离子交换的种类及条件
与疏水、反相介质结合的程度
产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制
是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体
决定亲和配基
决定分离提系及蛋白浓度
5. 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、 无热源。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
1. 含目的产物的起始物料的特点
2. 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中
的
3. 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。
4. ⑴ 菌体类型及其代谢特征：包括菌体的生物学性质，产
决定工艺采用的温度及流程时间
影响产物的回收
第二章基因工程制药part3
• 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法
方法
目的
离心/过滤
去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒
40nnm微孔膜过滤 进一步去除病毒
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤
去除沉淀物及病毒
透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓 度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响 复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。 对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺 （cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨 试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。 复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可 能是由于增加了复性中间体的可溶性。 复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。 通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在亲和层析柱上复性）。
•
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，
• 因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；
•
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵
• 体；
•
采用融合性战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，
• 拟首先选用亲合层析进行纯化
•
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用
• 低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
第二章基因工程制药part3
• 包含体的性质：
• 致密：折光性；组成（几乎全部都是过表达蛋白，杂 质主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白 •酶降解不敏感（发酵升温至42℃可促进包含体形成并进一 步抑制蛋白酶）
第二章基因工程制药part3
• 分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从 破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加 入变形剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变 性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究 中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在杂粮错误 折叠和聚合，复性效率往往很低。究其原因，蛋白质的立 体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天 然活性结构的过程还受到周围环境的影响。
•
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规
模产
• 业化过程未必合适，如：
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产
工
艺
第二章基因工程制药part3
• 包含体的形成：
• 原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所 形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的 内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大 肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键 的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间 有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含 体的产生有利有弊。
•
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种
技
• 术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
第二章基因工程制药part3
• 分离纯化过程的规模化
分离原理
分子大小
电荷 等电点 疏水特性
生物亲和性
常用的蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术
分离方法
特点
用途
凝胶过程
分辨率适中；分级分离式流速 较慢（﹥8h/循环）脱盐时流 速快（30min/循环）；容量受 限于样品体积
分级分离、适于脱盐，大规 模纯化的最后一步、用于去 除杂质的聚合体；脱盐可用 于任何阶段、特别是步骤衔 接时的缓冲液更换
分离出来，达到较高纯化倍数； • ⑶ 收率要高； • ⑷ 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或
调整，这样可减少工艺步骤； • ⑸ 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
第二章基因工程制药part3
• 1. 细胞破碎与固液分离
• ⑴ 细胞收集：离心和膜过滤
• ⑵ 细胞破碎：
•
机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。
组织培养细 胞
细菌、酵母
高压匀浆 研磨
高速珠磨
细菌、酵母、 植物细胞
细菌、植物 细胞
细胞混悬液
低渗裂解 冻融裂解
红细胞、 细菌
培养细胞
第二章基因工程制药part3
三．分离纯化的技术
• 分离纯化技术要求：
• ⑴ 技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； • ⑵ 选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物
发性
• 、吸附性能等。
3. 目的产物特性
4. 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对 分
5. 子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
4. 产品质量的要求
5. 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的 要
6. 求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种 类
3. 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温 度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏 感，容易使其失活、变性。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 基因工程药物或生物技术产品特 4. 点种类：繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂
5. 的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物 活性物质。
离子交换 分辨率通常较高；流速较快 最适于早期纯化，即大体积 （合适的填料）；容量很大， 样品且蛋白纯度较低时使用 样品体积不受限
第二章基因工程制药part3
避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，
如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。
使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，
如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）
和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴
骤，或干扰产品质量；
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑸ 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性 差的产物；
• ⑹ 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件 要求低，能耗低；
• ⑺ 具有较高的安全性
第二章基因工程制药part3
• 针对不同的产物表达形式采用不同的策略
7. 和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存 稳
8. 定性等。
第二章基因工程制药part3
二．分离纯化的基本过程
• 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细 胞
• 生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 • 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，
包
• 括 细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高 度
•一般认为，蛋白质在复性过程中，涉及两种疏水相互作用。 一是分子内的疏水相互作用，二是部分折叠的肽链分子间 的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠，后者导致蛋 白质聚集而无活性，两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 因此，在复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止 聚集，是提高复性收率的关键。
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进
行
• 分离的；
•
凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行
分
• 离的；
•
径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离
于
• 一体复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大
的
第二章基因工程制药part3
• 多种分离纯化技术的联合运用
• 素几方式等； • ⑷ 初始物料的物理，化学和生物特性：包括产物浓度、主
要 • 杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、
流 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
2. 物料中杂质种类和性质
•
物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电
荷性
• 质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥
物和
5. 副产物种类、产物在细菌内所处的位置，表达方式（胞内、
6. 胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降
解
7. 产物的酶类等；
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
• ⑶ 生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连 续
• 、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件 因
• 纯化直至得到纯化以及成品加工。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物分离纯化的一般流程
第二章基因工程制药part3
•各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法 旋刀式均浆
手动式匀浆
超声破碎
组织种类 大多数动、 植物组织 柔软的动物
组织 细胞浑浊液
细胞破碎方法 组织种类
酶溶
细菌、酵母
去垢剂渗透 有机溶剂渗透
侣作用，在细胞内过表达分子伴侣蛋白，促进外源蛋白的
正确折叠。
过表达二硫键异构酶可以促使蛋白的正确折叠，大肠杆菌
周质空间的DsbA蛋白的作用是引入新的二硫键，但是不催
化异构，DsbC是一种二硫键异构酶。
在培养基中加入硫醇也可以促进打开错配的二硫键，形成正
确的折叠蛋白。
第二章基因工程制药part3
第二章基因工程制药 part3
2020/12/10
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
基因工程药物或生物技术产品特 1. 点目的：产物在初始原料中的含量较低；
2. 含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还 有大量的细胞、代谢、残留物培养基、无机盐等，特别 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大。
第二章基因工程制药part3
• 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
•
等电点处于极端区域（pI≦5或 pI≧8）的重组蛋白
应
• 首选离子交换法进行分离，这样很容易除去所有的杂蛋
白
•；
•
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是
首
• 选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋
白
• 之间的解离常数应在合适的范围内（10-8~10-4 mol/L）； 第二章基因工程制药part3
•
非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。
• ⑶ 固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和
膜
•
过滤。
第二章基因工程制药part3
• 2. 目的产物的分离纯化
• 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术 分
• 为： • Ion exchange chromatography （IEC） • Reversed phase chromatography （PRC） • Hydrophobic interaction chromatography （HIC） • Affinity chromatography （AC）
第二章基因工程制药part3
•包含体的分离、溶解和复性
•细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆） •固-液相分离（离心）
•去污剂或/和低浓度尿素或盐酸源自文库洗涤，去可溶性蛋白和膜蛋白
•高浓度尿素或盐酸胍溶解包含体，可添加DTT(二硫苏糖醇) •打开二硫键
•逐步透析或稀释去除变性剂
第二章基因工程制药part3
疏水层析
去除残余的杂蛋白
凝胶过滤
与多聚体分离
0.22μm微孔膜过滤 除菌
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑴ 具有良好的稳定性和重复性； • ⑵ 尽可能减少组成工艺的步骤； • ⑶ 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，
工艺和设备相适应。 • ⑷ 在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步
第二章基因工程制药part3
• 产物的主要特性及在分离纯化中的作用
产物特征
作用
等电点 疏水性 特殊反应性 聚合性 生物特异性 溶解性 稳定性 微不均一性
决定离子交换的种类及条件
与疏水、反相介质结合的程度
产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制
是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体
决定亲和配基
决定分离提系及蛋白浓度
5. 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、 无热源。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 一．建立分离纯化工艺的根据
1. 含目的产物的起始物料的特点
2. 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中
的
3. 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。
4. ⑴ 菌体类型及其代谢特征：包括菌体的生物学性质，产
决定工艺采用的温度及流程时间
影响产物的回收
第二章基因工程制药part3
• 基因工程药物生产中常用的分离纯化方法
方法
目的
离心/过滤
去除细胞、细胞碎片、颗粒型杂质
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒
40nnm微孔膜过滤 进一步去除病毒
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤
去除沉淀物及病毒
透析或稀释速度，温度，pH，离子强度，目的蛋白的浓 度（通常10-100微克/ml）以及目的蛋白中的杂质会影响 复性过程，甚至导致目的蛋白聚集沉淀。 对含有二硫键蛋白，采用谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙胺 （cysteamine）等还原剂打开二硫键，使用过量的氧化硫氨 试剂或铜离子诱导的空气氧化可以加速二硫键氧化形成。 复性过程添加L-精氨酸有时可以大幅度提高复性效率，可 能是由于增加了复性中间体的可溶性。 复性过程添加某些去垢剂可以提高复性效率。 通过抑制分子间非特异性的相互的另一方法是使蛋白固定化 （在亲和层析柱上复性）。
•
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，
• 因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；
•
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵
• 体；
•
采用融合性战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，
• 拟首先选用亲合层析进行纯化
•
表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用
• 低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
第二章基因工程制药part3
• 包含体的性质：
• 致密：折光性；组成（几乎全部都是过表达蛋白，杂 质主要是细菌外膜蛋白，离心时一起沉降）；通常对蛋白 •酶降解不敏感（发酵升温至42℃可促进包含体形成并进一 步抑制蛋白酶）
第二章基因工程制药part3
• 分离包含体并复性蛋白质的操作步骤并不复杂，从 破碎细胞开始，然后将细胞匀浆离心，回收包含体后，加 入变形剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变 性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际研究 中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在杂粮错误 折叠和聚合，复性效率往往很低。究其原因，蛋白质的立 体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天 然活性结构的过程还受到周围环境的影响。
•
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规
模产
• 业化过程未必合适，如：
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）
实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）
因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产
工
艺
第二章基因工程制药part3
• 包含体的形成：
• 原核、酵母和真核生物由于异源和同源蛋白过表达所 形成的致密的不溶性颗粒。包含体的形成与过表达蛋白的 内在性质（如分子量、折叠途径等）无直接关系。因为大 肠杆菌胞质环境是一个还原性环境，所以含有较多二硫键 的蛋白较容易错误折叠形成包含体。相比之下，周质空间 有利于二硫键的形成，但是包含体的形成也会发生。包含 体的产生有利有弊。
•
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种
技
• 术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用
应首先选择能除去含量最多杂质的方法
应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
第二章基因工程制药part3
• 分离纯化过程的规模化
分离原理
分子大小
电荷 等电点 疏水特性
生物亲和性
常用的蛋白质、酶和重组蛋白质纯化技术
分离方法
特点
用途
凝胶过程
分辨率适中；分级分离式流速 较慢（﹥8h/循环）脱盐时流 速快（30min/循环）；容量受 限于样品体积
分级分离、适于脱盐，大规 模纯化的最后一步、用于去 除杂质的聚合体；脱盐可用 于任何阶段、特别是步骤衔 接时的缓冲液更换
分离出来，达到较高纯化倍数； • ⑶ 收率要高； • ⑷ 两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或
调整，这样可减少工艺步骤； • ⑸ 整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
第二章基因工程制药part3
• 1. 细胞破碎与固液分离
• ⑴ 细胞收集：离心和膜过滤
• ⑵ 细胞破碎：
•
机械法----高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。
组织培养细 胞
细菌、酵母
高压匀浆 研磨
高速珠磨
细菌、酵母、 植物细胞
细菌、植物 细胞
细胞混悬液
低渗裂解 冻融裂解
红细胞、 细菌
培养细胞
第二章基因工程制药part3
三．分离纯化的技术
• 分离纯化技术要求：
• ⑴ 技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； • ⑵ 选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物
发性
• 、吸附性能等。
3. 目的产物特性
4. 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对 分
5. 子量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水 第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化
4. 产品质量的要求
5. 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的 要
6. 求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种 类
3. 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温 度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏 感，容易使其失活、变性。
第二章基因工程制药part3
•基因工程药物的分离纯化 基因工程药物或生物技术产品特 4. 点种类：繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂
5. 的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物 活性物质。
离子交换 分辨率通常较高；流速较快 最适于早期纯化，即大体积 （合适的填料）；容量很大， 样品且蛋白纯度较低时使用 样品体积不受限
第二章基因工程制药part3
避免或减少包含体形成的有效方法是减缓蛋白合成速率，
如降低发酵温度、使用弱启动若启动子、降低基因剂量等。
使用亲水性蛋白作为融合伴侣可以增加融合蛋白的可溶性，
如谷胱甘肽硫转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）
和硫氧化还原蛋白（thioredoxin）后两者还具有分子内伴
骤，或干扰产品质量；
第二章基因工程制药part3
四．分离纯化工艺应遵循的原则
• ⑸ 分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性 差的产物；
• ⑹ 工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件 要求低，能耗低；
• ⑺ 具有较高的安全性
第二章基因工程制药part3
• 针对不同的产物表达形式采用不同的策略
7. 和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存 稳
8. 定性等。
第二章基因工程制药part3
二．分离纯化的基本过程
• 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细 胞
• 生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 • 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，
包
• 括 细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高 度