循环肿瘤细胞研究进展_任文君

循环肿瘤细胞研究进展任文君，孙国平(安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽合肥230022)摘要：循环肿瘤细胞（CTCs）存在于患者外周血中，是造成肿瘤转移和复发的主要原因。

外周血中的CTC是非常罕见的，要求检测方法具有高敏感性及高特异性，成为临床常规检测的巨大挑战，但是检测CTC在协助诊断、早期发现肿瘤的微转移、指导个体化治疗、评价治疗效果及预后方面上具有重要的临床意义。

该文将对其检测方法及临床应用进行探讨。

关键词：循环肿瘤细胞；检测；治疗Ashworth曾在1986年首次发现并提出循环肿瘤细胞（CTCs）的概念［1］。

CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞［2］。

肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞由原发灶脱落，侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在远隔脏器或原发脏器中定居，发展为转移灶［3-4］。

有些播散的肿瘤细胞和微小转移灶在切除原发灶后可以保持休眠状态并在若干年后形成转移灶［5］。

因此，在外周血中检测到CTC提示可能有早期转移存在，尤其是临床尚未发现的微转移病灶。

CTC的检测包括以下2个步骤：（1）富集，方法包括形态学或免疫学为基础的技术。

（2）检测，方法包括细胞计数和核酸检测技术。

因为CTC在外周血中是非常罕见的（1个CTC/106 107个单核细胞），富集细胞可提高检测的敏感性，富集之后则通过细胞计数或核酸检测技术利用肿瘤特异性标志物对CTC进行检测及分析。

1富集1．1以形态学为基础的富集膜滤过分离肿瘤细胞技术（ISET）通过肿瘤细胞体积大小进行富集［6］，就像一个微孔过滤器根据CTC的大小差异使其分离，其隔离灵敏度阈值接近每毫升全血一个癌细胞［7］，其优势在于不破坏CTC的形态，利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，但只适合部分肿瘤，不适合那些体积小于2倍粒细胞大小的肿瘤细胞。

基于密度梯度分离，单核细胞较其他血液成分密度低，因此可依据密度梯度差异将肿瘤细胞和单核细胞从其他血液细胞中分离出来，如Ficoll-Hypaque和Oncoquick。

与传统的Ficoll通信作者：孙国平，男，主任医师，博士生导师，研究方向：消化系统肿瘤，E-mail：sunguoping@anhmu．edu．cn 程序相比较，Oncoquick增加了多孔屏障，使得分离出的细胞更加纯化，检出率更高［8］。

由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性，因此缺乏特异性，易导致缺乏相应体积大小及密度梯度的肿瘤细胞的丢失，同时所富集的细胞不仅含有肿瘤细胞，还存在不同种类的其他细胞（特别是单核细胞），在后续检测过程中可能会因为肿瘤细胞的异质性和基因标志物的非特异性，造成假阳性结果。

1．2以免疫学为基础的富集免疫磁性分离技术（IMS），基于特异性免疫识别原理的富集技术，是目前应用最广泛的方法，通过特异性抗体包被的磁珠与细胞表面抗原特异性结合，形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外加磁场作用下，将CTC从血细胞中分离出来。

免疫磁性分离方式有2种：阳性分选和阴性分选。

阳性筛选获得目的细胞，阴性筛选去除无关细胞使目的细胞得以纯化，也可将两种模式结合，提高富集效率。

这项技术最大的优势在于可保证分离靶细胞的形态和功能的完整，有利于下一步CTC的计数、免疫细胞化学、PCR 等检测。

目前，免疫磁珠可达纳米级，结合时间短，灵敏度高10－7 10－6。

CellSearch系统是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术，是一种半自动技术，集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。

涂有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下被保留下来，接着采用荧光标记（CK8/18/19，DAPI，CD45）来区别CTC与血细胞，CTC 标记为CK8/18/19、DAPI（+），CD45（－），随后采用半自动荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析细胞大小和形态，最终确定CTC，只需要7．5mL血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。

这种半自动系统能快速分析样本，并有良好的重复性。

一个多中心研究，有学者提出Cell Search系统有82%的高富集率，且在乳腺癌CTC检测上有极［34］Ikeda T．Stem cells and neonatal brain injury［J］．Cell Tissue Res，2008，331（1）：263－269．［35］尹国才，张长征，张淼涛，等．人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12（12）：2281－2284．［36］Toda H，Takahashi J，Iwakami N，et al．Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats［J］．Neu-rosci Lett，2001，316（1）：9－12．［37］吴芳，杨佳勇，张敏，等．脐血间充质干细胞移植对脑性瘫痪儿童神经系统功能的影响：20例分析［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12（16）：3198－3200．［38］张敏，杨万章，吴芳，等．神经生长因子配合脐血源神经干细胞移植对脑瘫患儿运动功能的影响［J］．中国误诊学杂志，2008，8（23）：5596－5597．［39］杨万章，吴芳，张敏，等．脐血源神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床总结和分析［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（3）：287－290．（收稿日期：2012－05－25，修回日期：2012－10－26）·9·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)高的特异性及可重复性［9］。

CTC芯片是一项先进的检测技术，基于一个微流体技术平台将CTC分离的，当全血以一严格的速度及剪切力通过芯片时，结合有抗EpCAM抗体的显微位点便直接捕获CTC，这一系统以CK、DAPI作为阳性筛选，CD45作为阴性筛选，CTC 是CK（CAM5．2）及DAPI（+），CD45（－）。

仅需一个步骤，无需对血液样品进行预处理，且分离方式温和，获得活细胞。

在肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中CTC芯片都展现了其极高的敏感性及特异性。

最近，CTC芯片的升级版“HB芯片”是将第一代CTC芯片的显微位点转换为小室流动槽，增加了CTC与涂有EpCAM的凹槽接触机会，新型微流控芯片较原CTC芯片提高了捕获率及血液样本处理量［10］。

其他分离方法还有CAM和NV1066。

虽然目前在CTC 的分离上已取得巨大的进展，但是仍有许多问题亟待解决。

如在CTC向转移灶迁移时可能会经历上皮质间质转换（EMT），丢失上皮特异性标志物如EpCAM和CKs，而发展间叶细胞的特异性标志物如波形蛋白和钙黏蛋白［11-12］，这意味着以上皮细胞为靶细胞的富集技术会因丢失最有侵袭性的肿瘤细胞而受影响。

同时还面临肿瘤细胞异质性的挑战，CTC 可能不表达给定的标记物，造成假阴性结果，而上皮细胞特异性抗原不仅表达于上皮来源肿瘤，还可表达于非肿瘤上皮细胞造成了假阳性结果［13］。

目前需要更多努力来改善CTC的分离技术，设计出一种更准确、强劲的技术。

2检测一旦CTC被收集到，那么就需要识别程序来研究他们的起源和遗传学属性。

目前识别方法包括2大类：细胞计数和核酸方法。

2．1细胞计数的方法流式细胞术（Flow Cytometry，FCM），是集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，通过着色的单抗与特异性抗原结合来识别CTC，并对其进行多参数、快速的定量分析和分选的一种技术。

对比RT-PCR，流式细胞仪不仅可以得到高统计精度和亚组量化的信息，而且由于其可以快速同步分析多种参量，包括细胞大小、内部颗粒的性状，细胞表面和胞浆抗原，DNA、RNA含量，所以拥有高度特异性。

但是应用流式细胞仪从血液中检测上皮性肿瘤细胞其价值很大程度上依赖于可分析的细胞数量［14］，且目前的流式细胞仪相比RT-PCR敏感性较低，为10－5 10－4［15］。

光纤阵列扫描技术（FAST）是一个快速而准确地定位细胞计数系统，配备了扩大视野的光学收集系统，以每分钟500次的速率连续扫描定位荧光免疫示踪的CTC，这比传统的自动数字显微镜更快，而且无需富集步骤而直接检测，避免了CTC的丢失。

为了避免假阳性结果，建立了一个真阳性和假阳性的数据库来优化图像过滤器［16-17］。

上皮细胞免疫斑点（EPISPOT）是一种基于酶联免疫吸附测定原理的免疫学分析方法，通过检测CTC分泌的特殊蛋白（CKs，MUC，PSA，等）来计数CTC。

EPISPOT的一个特点就是只能识别有生命的细胞，因为死亡的细胞不能分泌足够数量的蛋白来检测［18］。

值得注意的是，活细胞比凋亡细胞更具临床意义，只有完整的、活的CTC才能导致转移灶形成。

检测的CTC分泌的特殊蛋白CK19时，EPISPOT的敏感性较ELISA高2个数量级［19］。

2．2以核酸为基础的方法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），通过分析组织、肿瘤特异性标志物从分子水平检测CTC，是目前最灵敏的技术。

其原理是以特异性mRNA作为模板，反转录成cDNA，再进行PCR扩增，获得目的基因表达。

所以PCR可以通过外周血中的细胞碎片检测到CTC特异性转录，而无需完整的、有活性的CTC。

RT-PCR的灵敏性很高，达10－7 10－6，故可分析极微量RNA。

然而，由于RT-PCR是以放大为原理的，所以很微小的污染也会造成假阳性结果。

实时逆转录聚合酶链反应（Qrt-PCR）的出现，提高了PCR特异性。

首先，通过内部探针与目标序列特异性结合，提高了的特异性。

其次，qRT-PCR对外周血中表达的标志基因设置了一个截断值，高于该值才被认为是CTC的真实信号。

同时由于放大信号的连续测量，假阳性结果很容易被识别［20］。

同时检测多种特异性基因表达可以增加实验的敏感性及特异性。

Chen Y等通过联合CK19，hMAM and CEA来检测早期乳腺癌患者的CTC数目，结果提高了检测灵敏性［21］。

目前，其在临床应用中最大的限制就是，缺乏明确的特异性标志物。

搜索恰当的肿瘤细胞特异性mRNA对于促进CTC检测的特异性及可靠性至关重要。

2．3临床应用目前的血清学标志物和高分辨成像技术仍无法准确识别肿瘤的微小转移和反映治疗的效果。

而从外周血中检测出CTC，提示可能有早期隐匿性转移的存在，检测CTC越来越被认为是肿瘤早期进展的标志。