基因工程药物指南

6 固定化： 固定化载体有海藻酸胶、卡拉胶、明胶、甲壳素等。 固定化培养大肠杆菌W3110（pTG201）240代没有测到 质粒丢失。
固定化方法 酶的固定化方法有下述4种：吸附法，包埋法，共价键结 合法，交联法
E E E
E E E E
E E E
E E E
E
E
E
E
E
吸附法
E
共价结合法 交联法 包埋法
几种常见的表达系统
大肠杆菌

原核表达系统
枯草杆菌 酵母

真核表达系统
哺乳动物细胞 昆虫细胞 植物细胞
（一） 原核细胞表达体系

大肠杆菌：最常用的表达形式。

大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
NH COOH
原核序列
真核序列
蛋白质在菌体内比较稳定；
融合蛋白本身不能做注射用药； 可以通过特殊设计，将两类蛋白分开。 凝血因子Xa专一识别 Ile-Glu-Gly-Arg; CNBr专一性切割甲硫氨酸。

② 以非融合蛋白的形式表达药物基因
外源基因的表达产物不含细菌多肽序列。 易被细菌蛋白酶降解； 常含有甲硫氨酸，用药时易引起免疫反应。 外源基因的结构
表达产物的运输
（2）分泌信号的效率：
表达产物的修饰
信号肽+前导肽
（3）终止序列的影响： 终止序列保证了转录产物（mRNA）在适当部位终止，并加上 polyA尾巴。
常用的终止子有：ADH1,
CYC1, MF∝1，PGK。
3 外源蛋白的糖基化


外源蛋白在酵母细胞中存在两种糖基化形式： N-糖苷键（天冬酰胺连接）和O-糖苷键（丝 氨酸或苏氨酸连接），与天然状态下相同。 酵母细胞能够识别这两种糖基化信号，使外 源蛋白正确折叠，产生与天然状态相同的蛋 白，分泌到胞外。
终止密码
3 枯草芽孢杆菌

优势：分泌能力强，将蛋白质产物分泌到细 胞液中，故不产生包涵体； 局限性：
具有极强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度的

降解； 能进行产物的糖基化。
4 链霉菌
——新的外源基因表达体系

优势：
非致病，使用安全；
分泌能力强，不形成包涵体；
具有糖基化能力； 已构建了一系列的表达载体； 下游培养工艺成熟。
1 原理
在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其 包进半透性的多聚物膜内。小分子的底物和产物均可 自由出入，而菌体细胞却不会漏出。
2 方法
常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂 以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例
将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸 胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合 。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。收率达72.5 ％
2 克隆载体

质粒转化酵母通常有两种方式：
碱金属离子（Li)介导的酵母菌完整细胞的转化 酵母菌电击转化法

鉴于从大肠杆菌转化和制备质粒比酵母容易的多，
可向酵母载体中引入大肠杆菌的起始和抗生素筛选 标记，此类克隆载体即可以在细菌中，又可以在酵 母中进行质粒复制和表型选择。
3 表达载体

啤酒酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统
引起免疫反应；
细胞周质内含有种类繁多的内毒素。
1、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
A. 外源基因的剂量 B. 外源基因的表达效率
① 启动子的强弱：容易被RNA聚合酶识别并能够稳定 结合； ② 核糖体结合位点的有效性；消除相关二级结构。 ③ SD序列和起始密码的间距； ④ 密码子组成；选择大肠杆菌偏爱的密码子。
包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 琼脂
菌种 大肠杆菌 大肠杆菌
短乳杆菌 链霉菌 大肠杆菌 大肠杆菌
酶系 谷氨酸脱羧酶 青霉素酰胺酶
葡萄糖异构酶 天门冬氨酸酶 青霉素酰胺酶 （裂解） 青霉素酰胺酶 （合成）
用途 制造γ-酪蛋白 生产6-氨基青霉烷酸(6APA)
从葡萄糖生产高果糖浆
明胶－戊二醛 聚丙烯酰胺 醋酸纤维素
阴离子树脂
DEAE-纤维素
放线菌
巨大芽孢杆菌
葡萄糖异构酶
青霉素酰胺酶
制造果糖
制造6APA
基因工程制药上游技术
基因分离
从基因组中直接分离 cDNA文库 PCR法 化学合成 平末端的连接 粘末端的连接
基因连接
抗生素筛选 蓝白斑筛选 序列筛选 基因转化筛选 真核、原核 表达系统 基因表达
生理代谢
菌种筛选
一、建立分离纯化工艺的根据

1、含目的产物的起始物料的特点
2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量要求

二、分离纯化的基本过程

一般包括如下几个方面的过程：细胞破碎、 固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至 得到纯品以及成品加工。
发酵液
细胞分离
胞内产物
细胞破碎 固液分离 包含体 变性 复性 细胞碎片分离

影响目的基因在酵母菌中表达的因素


1 外源基因的剂量：Fra Baidu bibliotek拷贝数质粒常会引起细胞生长 量降低。 2 外源基因的表达效率：
（1）启动子：
组成型启动子：在各个生长时期表达 诱导型启动子：受诱导物或诱导条件的影响
酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时
才能打开; PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子， PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在 35℃时失活，因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游 的外源基因在35℃时关闭，23℃诱导表达.
工程菌分裂时会产生不含质粒的子代菌，
二、提高质粒稳定性的方法 1 选择合适的宿主菌； 2 选择合适的载体； 3 添加选择压力；对结构不稳定质粒和大规 模生产无效。药物和食品生产时禁止使用抗生素 4 分阶段控制培养； 为提高培养过程中质粒的稳定性，一般采 用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一 定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。 在培养基中加入选择性压力如抗生素等， 以抑制质粒丢失菌的生长，也是提高质粒 稳定性的方法。
生产6－APA 生产半合成青霉素
二 载体结合法（吸附法）
1 原理
微生物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以 与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。
2 常用载体
离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAE－纤维素。
3 优缺点
优点：方法简单、载体易于再生。 缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。
载体结合法制备固定化菌体举例 载体 离子交换纤维素 菌体 丝状菌孢子 转化酶 酶 用途 蔗糖的转化

三 细胞的破碎方法

外力使用与否：机械法，非机械法 属性：物理法、化学法、生物法
匀浆法
物理法
珠磨法
细菌启动子 SD序列 AUG 结构基因
终止密码

③以分泌型表达蛋白药物的基因
外源基因的表达产物在胞质内合成，后被运输至
细胞周质，信号肽被信号肽酶识别、切割。
避免被细菌蛋白酶降解； 产物不含有甲硫氨酸； 产量不高；
信号肽不切割或切割位置不正确。
外源基因的结构
细菌启动子 SD序列 AUG 信号肽 结构基因
八、目的基因在受体细胞中的表达
基因表达：结构基因在生物体内的转录、翻 译以及所有加工过程。 基因工程中基因的高效表达：外源基因在生 物体内的转录、翻译以及所有加工过程

真核基因在原核细胞中表达的困难
1. 2. 3.
细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子 mRNA的SD序列不能与核糖体结合 真核蛋白易被细菌蛋白酶破坏
固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的酶不经过分 离提纯 直接用适当的方法将菌体加以固定来催化各种特定 的生物化学反应。 优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成
本低——与固定化酶比较
制备方法：与固定化酶相同，有包埋法、载 体结合法、交联法、热处理法、射线处理法 。 其中包埋法是最理想的方法。
一 包埋法
种子培养
发酵培养
基因工程菌的培养设备

发酵罐
第四节 基因工程药物的分离纯化
生物技术产品一般是活性肽或蛋白质，它们 具有如下特点：
①初始物料中含量低； ②基体组成复杂； ③稳定性差； ④种类多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂 的有机化合物，以及结构复杂而又性质各异的生物 活性物质； ⑤应用面广，要求质量、纯度高，无菌无热源等。
胞外产物
浓缩
初步分离
高度纯化
制 剂 产 品
基因工程药物分离纯化的一般流程
分离纯化要求：条件温和、选择性好收率 高、两个技术之间能直接衔接以及整个过 程要快，能满足高生产率的要求。 1、细胞破碎与固液分离： 收集—破碎—固液分离：离心、萃取、膜 技术等 2、目的产物的分离纯化：色谱方法 3、非蛋白质类杂质的去除：主要是DNA、 热原质和病毒。

大肠杆菌表达外源基因的劣势
大肠杆菌不存在信号肽，产物为胞内产物，提取时需裂解细胞，
导致产物含大量杂质；
蛋白产物常为包涵体，需经过复性才能恢复蛋白活性； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统，不适用于需糖基化修饰
的蛋白质；
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； 翻译常从AUG开始，目的蛋白的N端常多一个甲硫氨酸残基，会
C. 表达产物的稳定性
① ② ③ ④ 组建融合基因； 利用内源或外源信号肽将产物运送到胞间浆周质； 改变真核蛋白质二级结构； 采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌。Ion-营养缺陷型大肠杆 菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。
D 细胞的代谢负荷
外源基因的表达产物可能本身对宿主菌有毒性，或因消
耗其氨基酸等营养物质对宿主菌产生间接毒害。 解决方案：
第三节 基因工程菌的不稳定性

一、质粒的不稳定性
1 质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不
稳定 2 质粒的不稳定性产生的原因
（1）工程菌的质粒由于分裂的原因而不稳定；
造成质粒的丢失； 两种菌的比生长速率有差异。 （2）工程菌质粒结构的不稳定是由于DNA从 质粒上丢失、重排、缺失导致工程均性能的改 变。
状质粒成分。拷贝数可高达100-200。 （2）YRp类：非2m-来源的自主复制序列 （ARS）。拷贝数5-10。 （3）YCp类：非2m-来源的自主复制序列 （ARS）。含酵母染色体中心粒成分，拷贝数1。
（4）YIp类：含有可与酵母染色体重组的序 列，整合到酵母染色体中，随酵母染色体一 起复制，稳定性好。拷贝数1 。
1
I
R or I i R
P
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
同源重 组
REP 2
B
粒类似。
1 载体的分类：根据载体的复制序列分为 四类： （1）YEp类：复制序列为酵母天然的2m-双链环
将细胞的生长和外源基因的表达分为两个阶段； 将细胞的生长与质粒的表达分开；
蛋白质以包涵体形式存在。
E 工程菌的培养条件
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28℃时，每个 细胞的质粒拷贝数为60在42℃时，拷贝数迅速增至300 – 600。
2 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 ① 以融合蛋白的形式表达药物基因
二、提高质粒稳定性的方法

5 控制培养条件； 采用适当的操作方式可使工程菌生长速率具有优势，并 使工程菌和质粒丢失菌生长竞争趋于极端化。可调控的 环境参数为温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。通过 间隙供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
（二） 真核细胞表达体系
酵母：最有效的单细胞真核微生物。 常用啤酒酵母。 动物（哺乳动物和昆虫） 植物细胞


酵母表达外源基因的特点：
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简
便；
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉； 成功建立了几种有分泌能力的表达系统； 表达产物可以进行糖基化；具有原核细菌无法比拟的真核
蛋白翻译后加工系统；
不含有特异性的病毒、不产内毒素； 酵母菌是最简单的真核模式生物。
酵母菌的结构
酵母菌中的野生型质粒 酿酒酵母中的2m环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 REP FL
环状质粒，拷贝数达50至100个。
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 RA F STB A