利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。
与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。
技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。
结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。
技术路线
技术参数
样本要求。
外显子组测序信息分析
Base_covered_on_target(Mb)10 Coverage_of_target_region11 Fraction_of_target_covered_with_at_least_20x12 Fraction_of_target_covered_with_at_least_10x13 Fraction_of_target_covered_with_at_least_4x14
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
二、外显子组测序流程
基因组DNA的随机打断 DNA片段生物信息分析
三、外显子组测序信息分析流程
主要信息分析内容归类
3.1、数据过滤与评估 3.2、整体质量评估 3.3、SNP检测与注释 3.4、InDel检测与注释 3.5、高级分析
外显子组测序在医学研究中的应用
一 • 外显子组测序技术简介 二 • 外显子组测序流程 三 • 外显子组测序信息分析内容 四 • 外显子组测序的应用方案
一、外显子组测序技术简介
外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区 域DNA捕捉并富集后，再进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子组序列仅占全基因组序列的1%左右，与人类85% 致病基因突变相关。与全基因组测序相比，外显子组测序不 仅费用较低，而且测序覆盖度更深，数据准确性更高。
外显子组测序信息分析
外显子组测序信息分析外显子组测序技术的基本步骤包括DNA提取、文库构建、高通量测序和生物信息学分析。
首先，从样品中提取DNA，通常使用血液或组织样本。
然后，将DNA片段切割，并使用特定的引物将其扩增为文库。
接下来，将文库中的DNA片段进行高通量测序，产生大量的短读取序列。
最后，使用生物信息学工具对测序数据进行分析，以寻找变异并解读其意义。
外显子组测序的结果可以提供大量有关基因组的信息。
首先，可以检测SNV和Indel等单个碱基突变，这些突变可能与人类疾病的发生相关。
其次，可以检测到外显子区域的读框错移突变，这些突变可能会导致蛋白质的功能改变。
此外，还可以通过检测外显子区域的拷贝数变异(CNV)来揭示与疾病相关的基因缺失或复制。
最后，外显子组测序还可以帮助发现新的基因和调控元件，以及对个体之间的遗传差异和基因底物关系进行研究。
虽然外显子组测序技术已经取得了很大的成功，但仍然面临一些挑战。
首先，外显子组测序只能揭示外显子区域的变异，而无法揭示基因组的其他部分。
其次，由于测序数据的复杂性，需要进行大量的生物信息学分析，对于没有相关经验的研究者来说可能会有一定的难度。
此外，由于运营和存储测序设备的成本较高，外显子组测序对实验室和研究者的设施和经济资源要求较高。
总之，外显子组测序是一种强大的技术，可以揭示与人类疾病相关的基因变异。
通过对测序数据的分析和解读，可以帮助我们更好地理解基因组的结构和功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
尽管面临一些挑战，随着技术的进步和成本的下降，外显子组测序在个性化医学和遗传学研究中将发挥越来越大的作用。
全外显子测序报告解读原则与技巧
全外显子测序报告解读原则与技巧全外显子测序是利用高通量测序技术对生物体全基因组外显子区域进行测序，从而揭示人类个体及群体基因组中与疾病相关的基因变异，是现代个性化医学的重要技术手段之一。
下面我们将介绍全外显子测序报告的解读原则和技巧。
解读原则：1.全面性：全外显子测序提供了全面、高通量的大量数据，必须对其进行全面、深入的解读。
同时需要结合临床资料，以全面、系统性的方式进行解读。
2.多参考性：全外显子测序可能会检测到一些变异，但并不一定与致病性相关。
因此，需要根据多个参考数据库、文献资料以及基于家系检测的疾病遗传性等多方面的数据进行判断和筛选。
3.个体化：全外显子测序报告需要与具体个体相关的临床资料、家族病史等进行结合，重点考虑与之相关的变异是否致病、临床意义何在等方面。
4.实用性：全外显子测序报告应当具有实用性，得出的结论应当能指导个体的诊断、治疗与遗传咨询。
解读技巧：1.对阳性结果进行验证：全外显子测序可能会检测到大量的单核苷酸多态性（SNP）、小的结构变异等，为了保证结果的精确性，最好对阳性结果进行验证，可以使用参考文献、数据库或其他现代检验技术进行检验。
2.避免过度解读：全外显子测序结果的解读需要考虑基因本身的复杂性，并非所有的变异都与疾病相关。
因此不应过度解读，需要根据科学方法进行分析和评价。
3.结合病史、家族史等临床资料：全外显子测序结果需要结合实际临床背景进行解读，包括基因检测的目的、临床表现、影响家庭、遗传风险等因素。
4.遵循实践指南：目前许多学会和机构都制定了全外显子测序报告解读的指南，如美国基因组医学协会（ACMG）和全球基因组联盟（GA4GH）等，解读应该遵循指南的原则和标准。
总之，全外显子测序是一项高复杂性的技术，其结果的解读需要谨慎，需要全面、深入地理解和分析，以确保结果的准确性和实用性。
同时，我们需要结合个体的临床信息和基因组数据来指导临床医生的决策和个体的诊断治疗方案，为个性化医学做出贡献。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
全外显子组测序解析卵巢早衰的遗传机制
The New England Journal of Medicine全外显子组测序解析卵巢早衰的遗传机制截止目前，在卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）病例中发现了染色体缺失、重组、以及常染色体或X染色体上的突变等多种遗传变异，但是大多数卵巢早衰患者的遗传病因仍未明确。
巴黎大学的研究人员通过全外显子组测序，验证了 研究成果发表于2014年3月的The New England Journal of Medicine（IF:55.873）。
讨论本研究利用外显子组测序首次在卵巢早衰中东家系（MO1DA）中发现STAG3突变导致隐性遗传卵巢早衰，为探索卵巢早衰或卵巢功能不全的发生机理、及阐明该病的临床高度异质性和遗传病因复杂性开辟了新的研究途径。
首页 科技服务 医学检测 科学与技术 市场与支持 加入我们 关于我们提供领先的基因组学解决方案Providing Advanced Genomic Solutions阅读原文>>研究方法取 材建 库测 序Agilent SureSelectXT 50 Mb Exon Capture Illumina HiSeq 2000；测序深度50×中东家系（MO1DA）中的1个卵巢早衰患者和1个未患病同胞姐妹（其父母为近亲结婚）Stag315 DaysStag31. STAG3纯合突变筛选对家系中的两姐妹进行外显子组测序，其中一个患有卵巢早衰（IV-1），另外一个不患此病（IV-3），测序结果发现患者IV-1的7号染色体上有一个大的纯合区域，并发现位于7q21.3–22.2内的6个基因发生突变，根据基因的已知功能或表达结构域排除了其中5个基因，最后锁定一个基因 — STAG3，STAG3 发生了移码突变（c.968delC）。
外显子组测序信息分析
生物学功能研究 Functional research
在多个家系或散发病例中进行突变筛查研究 Mutation screening
4.2 WES肿瘤研究上的思路
样本选取
样本选取
13721 92.05 47.31
12636 90.86 46.75
9776 66.84 43.05
9616 64.37 41.45
6904
6815
6684
6437
当比对到参考基因组目标区域的数据量在60%之上，认为外显子捕 获效率合格。
3.2.3、染色体覆盖深度分布
注：横坐标为染色体长度，纵坐标为覆盖深度取对数。
注： Codons：密码子的变化情况；Substitution：氨基酸的替换信息；SNP Type： SNP的类型；Prediction：预测结果(damaging/tolerated)，TOLERATED表示这个突变 是可以容忍的，即对蛋白质功能没有影响或影响很小，DAMAGING表示突变是有 害的，即对蛋白质功能有较大影响； Gene ：发生替换所在的基因。
3.5.4 、样品间差异表达基因GO分类统计
差异基因GO注释聚类图
topGO有向无环图
3.5.5 、样品间差异表达基因KEGG注释
差异基因KEGG通路示意图
四、外显子组测序的应用思路
4.1 WES找寻孟德尔疾病致病基因思路
遴选和采集 病例和家系 Samples collection
全外显子测序 Whole-exome sequencing
R04 16573 17840 30639 3774 34413
基于全外显子组测序的致病性突变的分析研究
基于全外显子组测序的致病性突变的分析研究随着DNA测序技术的发展，全外显子组测序已成为了一种广泛应用的高通量测序技术。
相比于传统的Sanger测序技术，全外显子组测序覆盖面更广，能够检测到更多的突变，因此在致病性突变的分析研究中得到了广泛的应用。
一、全外显子组测序原理全外显子组测序就是通过对个体全部外显子区域进行测序，来检测基因组DNA的突变状态。
测序读段通过高通量测序仪进行自动化测序和拼接，生成整个基因组的测序片段组，然后进行基因突变位点分析和注释，并将结果与全球数据库进行比对，来确定基因的功能和表达情况。
常用的分析软件包括GATK、VariantStudio、ANNOVAR等。
二、全外显子组测序在致病性突变分析中的应用全外显子组测序是一种高效、准确、全面的技术，被广泛应用于致病性突变的分析研究中。
它能够检测到各种类型的致病性突变，如错义突变、无义突变、插入/缺失、剪接变异等。
通过全外显子组测序分析，可以确定基因的整体突变情况，挖掘出与疾病相关的突变位点，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
例如，对于帕金森病的研究，全外显子组测序可以帮助鉴定突变，并发现新的针对该疾病的药物靶点。
对于遗传性视网膜疾病的研究，全外显子组测序可以检测出疾病相关的基因突变，并为个性化治疗提供基础。
三、全外显子组测序技术的挑战和应对全外显子组测序技术虽然具有高效、全面的优势，但也面临着一些挑战。
例如，由于基因的复杂性，在全外显子组测序中可能会遗漏一些重要的突变。
此外，全外显子组测序对样本的要求较高，需要较高的DNA质量和浓度，否则会影响数据的准确性。
针对这些挑战，研究人员也在不断地进行技术的改进和优化。
例如，加强样本的质量控制和样本的深度覆盖，可以提高数据的准确性；通过结合其他测序技术，如RNA测序、基因芯片等，可以增加对基因功能的深度分析。
四、结语全外显子组测序技术的应用正在推动致病性突变的分析研究领域不断向前发展。
全外显子组测序法对一中国常染色体显性遗传先天性白内障家系GJA3基因突变位点的分析解析
遗传方式。患者均双眼发病，晶状体混浊以皮质性为主。先证者全外显子组测序后分析发现，１３号染色体 ＧＪＡ３基因的２号外显子第１４３位核糖核苷酸Ａ突变为Ｇ（ｃ．１４３Ａ＞Ｇ），导致其编码的第４８位氨基酸由谷氨 酸变为甘氨酸（Ｐ．Ｅ４８Ｇ）。ＰＣＲ扩增产物测序结果显示该家系中患病受检者ＤＮＡ均有此突变，但该家系中表 型正常的受检者及１００名健康对照者该候选基因均不存在此突变。 家系的致病基因突变位点，增补了ＧＪＡ３基因的突变谱。 【关键词】 白内障／遗传；连接蛋８／基因；错义突变；全外显子组测序；氨基酸序列
结论ＧＪＡ３基因ｃ．１４３Ａ＞Ｇ为该ＡＤＣＣ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧＪＡ３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ－ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ａ
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃａｔａｒａｃｔ ｂｙ
ＡＤＣＣ ｂｙ ｗｈｏｌｅ—ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｔｏ
Ｃｈｉｎｅｓｅ ＡＤＣＣ
ｆａｍｉｌｙ
ｗａｓ
ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｉｎ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ Ａｕｇｕｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ．Ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｔｘｌ
传异质性Ｍ一７｜，为先天性白内障的发病机制研究及其
防治带来了一定困难。为了更好地了解先天性白内障 的发病过程，本研究中对一ＡＤＣＣ家系进行突变基因 的筛查和分析。 １资料与方法 １．１一般资料 于２０１４年８—９月收集在郑州大学第一附属医院 就诊的一先天性白内障汉族家系，该家系共５代６８名 成员，均行详细的眼部检查，包括视力、眼位、眼球运 动、眼压、眼前节裂隙灯显微镜检查及眼底检查，同时 收集１００名与本家系成员无亲缘关系的健康体检者 （无高血压、糖尿病等系统性疾病及眼部疾病等）作为 正常对照。本研究方案经郑州大学第一附属医院伦理 委员会审查批准（２０１４年科研第４３号），严格遵循赫 尔辛基宣言，所有参与者或其监护人均签署知情同意书。 １．２方法
检测基因突变快速方法研究评估分析
检测基因突变快速方法研究评估分析现如今，基因突变已成为影响人类健康和疾病发展的一个重要因素。
为了能够准确、快速地检测基因突变，科学家们不断探索研发各种方法。
本文将对目前研究评估分析基因突变快速检测方法进行探讨。
一、引言基因突变是指染色体上发生的DNA序列中的改变。
它们可能是与疾病发展密切相关的致病基因突变或者是与自然进化相关的中性基因突变。
因此，准确、快速地检测基因突变对于疾病的早期诊断和有效治疗至关重要。
二、PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种在实验室中合成和扩增特定DNA片段的技术。
通过PCR技术，可以使少量的DNA迅速扩增到足够数量，以便进行后续的分析。
PCR技术在基因突变检测中被广泛应用。
例如，聚合酶链反应-限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP）和聚合酶链反应-测序（PCR-sequencing）等都是常见的PCR技术应用。
三、高通量测序技术高通量测序技术（Next-generation sequencing, NGS）是一种可以同时对数千个DNA分子进行测序的方法。
基于高通量测序技术，科学家们可以更全面、高效地检测基因突变。
例如，外显子组测序可以快速筛选和检测与疾病相关的基因突变。
此外，使用高通量测序技术还能够进行全基因组测序、全转录组测序等。
四、电化学检测方法电化学检测方法是一种基于电化学信号的基因突变检测技术。
这种方法通过利用特定的电极和活性物质来检测DNA序列中的突变。
该方法具有高灵敏度和高特异性的优点，可以快速准确地检测基因突变。
其中，电化学DNA传感器和电化学免疫传感器等都是常用的电化学检测方法。
五、微流控技术微流控技术是一种能够在微尺度上操控和分析流体样品的技术。
与传统的实验室操作相比，微流控技术具有样品量少、实验时间短、自动化程度高等优点。
在基因突变检测中，科学家们已经成功地利用微流控技术开发出了一些高效的检测方法。
例如，微流控芯片结合PCR 或者高通量测序技术可以实现快速、准确地检测基因突变。
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。
-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。
2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。
- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。
- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。
4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。
-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。
一文读懂全外显子测序家系突变筛选策略
一文读懂全外显子测序家系突变筛选策略最近老师和同学经常问针对外显子测序的家系遗传病如何进行突变筛选,今天小編就撰稿一篇,希望对老师和同学有所帮助,话不多说,直接看下面的干货。
小编碎语：DNA测序中从测序区域的大小分为全基因组重测序，全外显子测序，靶向区域测序。
全外显子大概占DNA全部碱基对的1%，即大概30M的碱基，目前大部分测序的全外数据量为10G，测序深度大概为100X-150x左右，不同的试剂盒导致不同的捕获效率的不同，不同试剂盒的均一度的不同导致不同区域实际深度不同，由于全外显子测序检测数据量适中(约10G)，与全基因组相比(约90G)，因为人类疾病有90%在外显子区域,全外显子测序十分具有性价比，可以发现与人类疾病关系密切的外显子部分的相关基因突变。
全外显子的测序应用十分广泛，整体从技术上来说，1)可以检测 SNV 的 germ line 突变;2)也可以在一定程度上检测肿瘤的somatic 突变(深度200X以上);3)可以检测外显子区域的CNV, 融合等突变;从外显子测序技术延伸出的临床应用来说，可以应用于以下的方面：1)确定孟德尔遗传疾病相关基因；2)风险易感基因的发现(与全基因组关联分析类似);3)癌症相关研究(高深度情况下);全外显子测序的高通量分析流程如下：不同试剂盒导致捕获效率的不同，不同试剂盒均一度的区别导致不同区域实际深度差异,下表为目前市场上主流试剂盒的比较。
孟德尔遗传疾病相关研究(家系筛选)通过全外显子生物信息分析，通过初步将得到一些可能的致病突变;如果知道样本家系属于何种致病模式，可以使用不同的筛选模式进行筛选。
筛选模式有：1)常染色体隐性遗传甲、乙：隐性遗传表现为双亲都没病，孩子患病。
患病个体亲代是突变携带者但表型正常，子代患病，如果不存在近亲结婚或生殖隔离等因素，往往患者同一致病基因的不同位点存在致病突变，即患者带有复合杂合突变（compound heterozygous mutations）。
外显子组学
外显子组学全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：外显子组学（exome sequencing）是一种高通量测序技术，通过测定细胞内所有外显子的DNA序列来识别与疾病相关的遗传变异。
外显子是编码蛋白质的DNA序列片段，占全基因组的约1%。
与全基因组测序相比，外显子组测序更便宜、更快速，并且能够准确识别蛋白质编码区域的遗传变异。
外显子组学的发展为遗传疾病的诊断和研究提供了新的机会。
许多遗传性疾病是由外显子中的点突变或小片段插入/缺失引起的，外显子组学可以帮助医生和研究人员快速准确地发现这些变异。
外显子组学还可以用于疾病的早期筛查、药物靶点的发现以及个性化医疗的实施。
外显子组学技术的原理是先将DNA进行复制和片断，再通过测序仪器对DNA序列进行测定，最后通过计算机算法对测定结果进行分析和比对。
这一技术的应用范围非常广泛，可以涵盖从个体基因组到完整种群遗传组成的所有尺度。
外显子组学已经在多种疾病的研究和诊断中取得了成功，比如罕见遗传病、癌症、心血管疾病等。
外显子组学的发展也面临着一些挑战和问题。
首先是数据分析和解释的复杂性，外显子组学测序可以产生大量的数据，如何从中提取有用信息是一个值得研究的问题。
其次是测序结果的准确性和可靠性，虽然外显子组学技术已经非常成熟，但仍然有一定的误差率存在。
外显子组学在临床应用中还需要克服一些道德与法律方面的挑战，比如隐私保护、数据共享等问题。
第二篇示例：外显子指的是基因组中编码蛋白质的DNA序列，而外显子组学则是利用高通量测序技术，对这些外显子进行测序和分析，以寻找与疾病相关的变异。
与全基因组测序相比，外显子组学能够更加精准地筛选出与疾病相关的基因变异，从而为疾病的诊断、治疗和预防提供更为有效的数据支持。
外显子组学的应用领域非常广泛，包括但不限于疾病的遗传机制研究、个体化医学的发展、药物疗效的预测等。
通过外显子组学技术，科学家可以快速准确地识别出与疾病相关的基因变异，为相关疾病的诊断提供重要线索。
外显子组测序ppt课件
1）基因注释： 通过基因注释可以达到以下的目的： a. 突变的功能定位(在外显子，内含子，剪接位点还是基因间区)； b. 突变所在的基因名称或者临近的基因； c. 突变如果在编码区域，是否引起氨基酸的改变(同义突变，非同义突变
的呢过)； d. 如果引起氨基酸的改变，按照HGVS命名规则表示--改变的基因ID，转录
9.注释：
通过ANNOVAR软件对vcf结果注释，关联到多个数据库。
18
五、数据分析内容 1. Mapping统计： 统计总reads数，mapped reads及unique mapped reads数目及百分比。 2. 捕获效率统计： 统计来自捕获区域的Fragment比例：
19
统计target区域所有的碱基覆盖次数分布：
对每个target区域的覆盖和深度统计： 如果客户对某些基因特别感兴趣，想要看看来自这些基因的外显子区域的覆盖情 况，可以提供每个target或者特定target区域的覆盖情况和测序深度统计。
20
3. Snv和indel关联数据库： Snv和indel结果按照突变的位点是否在捕获的区域之内分成两部分： *_target.snv：突变处于捕获的靶区域(target region)内。 *_off_target.snv或者*_target.indel: 突变在捕获的靶区域之外。 Snv和indel结果与以下的数据库关联，为突变的筛选提供大量的信息。
1. Choi M, Scholl U I, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(45): 19096-19101.
检测罕见病基因突变的新技术综述
检测罕见病基因突变的新技术综述罕见病是指罹患人数较少的疾病，通常是由基因突变引起的。
由于罕见病的病例数量有限，传统的基因检测技术在诊断和治疗上存在一定的局限性。
然而，随着科技的不断进步，新的检测技术不断涌现，为罕见病的基因突变检测提供了更为准确和有效的手段。
本文将对检测罕见病基因突变的新技术进行综述，探讨其在临床应用中的意义和前景。
一、全外显子测序技术（WES）全外显子测序技术是一种高通量测序技术，能够对一个个体的所有外显子进行测序。
通过WES技术，可以全面地检测基因组中的突变，包括罕见病基因的突变。
相比传统的Sanger测序技术，WES技术具有更高的效率和准确性，能够更快地发现罕见病的致病基因。
近年来，WES技术在罕见病的诊断中得到了广泛应用，为患者提供了更准确的诊断结果和个性化的治疗方案。
二、全基因组测序技术（WGS）全基因组测序技术是一种对个体的整个基因组进行测序的技术。
与WES技术相比，WGS技术能够检测基因组中的所有变异，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失突变等。
通过WGS技术，可以更全面地了解个体的遗传信息，发现罕见病的潜在致病基因。
虽然WGS技术的成本较高，但其在罕见病基因突变检测中的应用前景广阔，有望为罕见病的诊断和治疗提供更为全面和精准的信息。
三、单细胞测序技术单细胞测序技术是一种能够对单个细胞进行基因组测序的技术。
在罕见病的研究中，由于病例数量有限，传统的群体测序技术可能无法发现罕见病基因的突变。
而单细胞测序技术能够在单个细胞水平上进行基因组测序，发现罕见病基因的突变，为罕见病的病因研究提供新的思路和方法。
单细胞测序技术的出现，为罕见病的基因突变检测带来了新的突破，有望为罕见病的诊断和治疗提供更为精准的信息。
四、人工智能技术在罕见病基因突变检测中的应用人工智能技术在医学领域的应用日益广泛，包括在罕见病基因突变检测中的应用。
人工智能技术能够通过大数据分析和机器学习算法，快速准确地识别基因组中的突变信息，帮助医生进行罕见病的诊断和治疗。
外显子组测序技术的原理及应用概述
外显子组测序技术的原理及应用概述李法君（山东省潍坊科技学院2627〇〇)摘要外显子组测序是利用序列捕获技术将基因组外显子区域捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
近年来，该技 术被广泛应用于单基因遗传病和肿瘤等复杂疾病的检测以及动植物等领域的研究。
本文综述了外显子组测序技术的基本原理及 其在相关领域研究中的应用。
关键词外显子组测序技术基因组单基因疾病肿瘤随着社会生活水平的提高，健康问题越来越多地 受到关注。
传统遗传疾病的鉴定多采用染色体显带分 析、核型分析和遗传标记等方法来寻找与疾病相关的 DNA变异。
这些方法虽然各有特点，但都存在效率低 下、工作量大和分辨率低等问题。
21世纪初，随着人 类基因组计划和国际人类基因组单体型图计划的相继 完成以及高通量生物芯片技术的快速发展，研究人员 得以利用全基因组关联研究（genome-wideassociation study，GWAS)的方法来筛选复杂疾病的易感基因，并 取得了举世瞩目的成就，掀起了人类基因组研究的第 三次浪潮[1]。
但GWAS技术也存在自身的局限性，如 对稀有的变异和结构变异不敏感，易出现假阳性结果 等[2,3]。
与此同时，研究人员还意识到对疾病及性状表 型起着关键作用的变异主要来源于编码区，即外显子 的差异[4’5]，而前期的研究则多聚焦于非编码区的变 异，对外显子变异的关注度较欠缺。
由于全基因组测 序费用高昂，因此在研究可用的财力资源一定的条件 下，外显子组测序技术更适合探索高深度测序数据的 大批量样本研究。
基于上述原因，众多研究者开始优 先关注编码区的信息，从而加速了外显子组测序技术 的出现。
外显子是蛋白质的编码区，是真核生物基因组的 一部分，含有合成蛋白质所需的遗传信息，基因组中的 全部外显子称为外显子组。
如人类基因组大约有1.8X105个外显子，总长30 Mb，尽管只占人类基因组 的1%，但存在与个体表型相关的大量功能变异。
发现基因突变的方法
发现基因突变的方法遗传学是生物学的分支学科，研究的是物种迭代过程中的遗传信息传递与表达。
基因突变是指因突变引起的遗传信息的改变，它是遗传学中重要的研究对象，对于疾病的治疗、人类进化、农作物育种等方面都有着重要意义。
如何发现基因突变？下面我们将详细介绍一些常见的基因突变发现方法。
一、测序技术测序技术是目前常用的基因突变发现方法。
通过全基因组测序和外显子组测序，可以检测个体基因组的所有区域，以发现所有的单核苷酸多态性、插入/缺失和结构变异等基因突变。
其中全基因组测序适用于寻找很罕见的变异，并且可发现一些未知的基因突变，而外显子组测序适用于检测与疾病相关的基因变异。
另外，PCR技术也是一种基因突变发现方法。
PCR技术是通过引物扩增目的基因区域的DNA，然后进行测序，发现基因突变。
PCR技术不仅具有高灵敏度和高准确性，而且操作简单，是一种常用的突变检测技术。
二、比较基因组学比较基因组学是指比较两个或多个物种基因组序列，寻找共性和差异的一门学科。
通过比较基因组学的方法，可以发现一些地区居民的基因突变和种群基因多样性。
比较基因组学的方法也被广泛应用于揭示病原菌和宿主之间的进化关系，以及揭示植物和动物进化的历史。
三、功能分析功能分析是一种基因突变发现方法。
它不仅可以发现基因突变，而且可以进一步研究基因突变引起的遗传逻辑。
例如，基因表达谱分析可显示基因的表达模式与一些特定生理或病理条件的关系，而蛋白结构预测和功能预测可进一步揭示突变导致的结构和功能变化，预测突变对蛋白功能的影响。
四、群体遗传学群体遗传学是指研究群体基因结构、基因频率、基因组组成和群体遗传变异等的一门学科。
通过集体遗传学方法，可以检测种群中的基因突变和基因型变异。
群体遗传学和比较基因组学结合起来，可以揭示人类进化过程中构成本体多样性的基因突变。
以上介绍的是一些常见的基因突变发现方法。
现在，随着技术的进步，新的基因突变发现方法也不断涌现。
这些发现方法的应用，不仅增加了我们对生命本质的理解，同时也为研究各种疾病的病因和治疗提供了新视角。
外显子信息分析简介
比对结果统计
statistics
Input Reads
mapped Multiple
Unique R1 mapped R2 mapped
Percentage
48948102(1 00%)48212358(9 8.50%)
561991(1.1 5%)
47650367(9 7.35%)
24118187(4 9.27%)
该reads。 3. 过滤低质量reads，过滤掉Q20<70% reads。
过滤统计
read
raw adapter N Low qual clean
read1
28701483 (100%)
53796%1()0.129(0.00%)
1849520( 6.44%)
25779623 (89.82%)
read2
InDel：Insertion/Deletion，插入/缺失，在基因组重测序进行mapping时，进行容 Gap的比对并检测可信的Short InDel，如基因组上小片段>50bp的插入或缺失。在 检测过程中，Gap的长度为1~5个碱基。
CNV：copy number variation，基因组拷贝数变异，是基因组变异的一种形式， 通常使基因组中大片段的DNA形成非正常的拷贝数量。如人类正常染色体拷贝数 是2，有些染色体区域拷贝数变成1或3，这样，该区域发生拷贝数缺失或增加，位 于该区域内的基因表达量也会受到影响。
28701483 22886(0.0 58357(0.2 1798947( 25779623
(100%) 8%)
0%) 6.27%) (89.82%)
过滤前后质量值
过滤前： 过滤后：
比对
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– case common missense/stop/coding_change/frameshift/splice/ ncRNA snps NOT in family controls, – with 1000genomes(ALL & ASN) and ESP6500 frequency <16%(MAF<0.16), – compared against SKLMG sequenced controls & cases
第四步：变异检测
• 运用 GATK/MuTect/VarScan/Atlas2 /Samtools /SVDetect /Polymutt等工具包， 查找 SNP和 Indel、缺失、插入、倒位、易 位、CNV等
– 我们目前采用GATK工具包 – GATK寻找SNP&Indel突变的流程图
• GATK Best Practices
SNP & Indel
突变注释（dbSNP，1000g，ESP6500， DGV等，位置，功能，保守性，通路， 蛋白互作网络…）
突变筛选，可视化 生成分析结果报告 突变验证，提送临床医生，生产件转换 成fastq文件
FASTQ file format
FASTQ 文件示例，该文件包含一条序列：
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
Variant Call Format (VCF) 是用于存储基因序列变异的特定文本文件格式，该格式是随着 大规模基因分型和DNA测序而出现的，如千人基因组计划。它包含描述元数据的行，然后是数据 表头行，后面的数据行每行包含基因组中一个位置的信息（如变异信息）。
VCF（Variant Call Format）文件（示例）
• Integrated Genomics Viewer (IGV)
（/software/igv/home ）
– 浏览大型基因组数据的高性能交互式视图 – 整合了NCBI refGene数据、hg19、hg18等不同 版本的人类参考基因组 – 可在本地交互式查看局部比对 – 可同时查看多个样本的比对，支持多种数据类 型
第三步：将序列比对到参考基因组
• 目的：对测出的序列片段进行定位，看位 于参考基因组上的哪个位置
• 生成SAM或BAM（二进制）文件
– 比对工具如：BWA，bowtie2，Illumina的 Hiseq Analysis Software ，SOAP等，我们用的 BWA mem
Bam文件用igv工具展示示例
显性 隐性
过滤正常人数据库 dbSNP, 1000 Genome Project, ESP, in-house数据库，
基因纯和或复合杂合位点
过滤正常人数据库
对蛋白功能影响的预测
dbSNP,1000 Genome Project, ESP, in-house数据库， 如：去除高频突变
变异筛选结果示例（ SNP&Indel）
• 非编码改变的影响预测准确性还相对有限， 通过数量性状定位或关联分析的文献数据
来预测是目前最为有效的方法
第六步：变异筛选 （举例，并非唯一方案）
找出患者共有而正常对照没有的变异 去除不影响功能的变异，如同义变异、基因间区、内含子区的变异， 保留Missense, nonsense, splice site, frameshift, cds-indel等变异
利用外显子组测序检测一个家 系突变的分析方法介绍
郑宇
2014-12-18
提纲
• NGS 测序简介 • 分析基本流程
– – – – – – 质量过滤 比对 寻找变异 变异质量过滤 变异注释 家系或群体样本综合分析过滤
（一）
NGS测序简介
DNA 测序简介
• 针对单个小扩增片段进行的Sanger测序(1-1000bp)
（二）
数据分析基本流程
分析目的：变异检测
• DNA变异常见类型：
– 单核苷酸多态（SNP）和短片段插入缺失 （Indel） – 缺失（deletion） – 插入（insertion） – 倒位（ inversion） – 易位（translocation） – 拷贝数变异 （CNV）
NGS数据分析基本流程
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
• 实践显示，多种不同软件共同识别的变异 有更高的可靠性，因此有建议使用 consensus calls
第五步：变异注释
• 帮助预测变异的生物学功能或意义 • 运用 Annovar、SeattleAnnotation、 GenomeTrax等工具对每一变异筛查dbSNP、 1000genomes、PolyPhen、SIFT、 ESP 、 HGMD、OMIM、KEGG Pathway、CNV、 DGV等数据库，评估表型或疾病风险
（ /gatk/guide/best-practices）
Snp&Indel生成VCF或者GVCF格式结果文件
VCF格式
vs.
GVCF格式
VCF 格式
##fileformat=VCFv4.0 ##fileDate=20110705 ##reference=1000GenomesPilot-NCBI37 ##phasing=partial ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data"> ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth"> ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency"> ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele"> ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129"> ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership"> ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data"> ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality"> ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth"> ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality"> #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3 2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,. 2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3
• 第三代测序
– 无需PCR实时测，读长更长，但通量低，准确性有待提 高
目标序列捕获测序
• 针对外显子组区域或用户定制的特定染色体区 域，主要检测目标区域内的点变异 • 目标序列捕获测序可用于家系研究，也可用于 较大样本量的病例-对照研究。对于已经完成 连锁分析的家系，可将疾病连锁区间及附近的 DNA区域或外显子序列进行捕获后进行测序 • 相比全基因组测序更加经济、高效，但由于捕 获技术本身的局限性，也不能100%检测所有 的外显子或SOLiD…）
加测/重测数据
质量差或 产量不足
质量评估(数据产量和质量)， 并去除低质量碱基 序列拼接组装（比对，去重，indel重 新比对，碱基质量重新计算）