利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412

第四步：变异检测
• 运用 GATK/MuTect/VarScan/Atlas2 /Samtools /SVDetect /Polymutt等工具包， 查找 SNP和 Indel、缺失、插入、倒位、易 位、CNV等
– 我们目前采用GATK工具包 – GATK寻找SNP&Indel突变的流程图
• GATK Best Practices
• 第三代测序
– 无需PCR实时测，读长更长，但通量低，准确性有待提 高
目标序列捕获测序
• 针对外显子组区域或用户定制的特定染色体区 域，主要检测目标区域内的点变异 • 目标序列捕获测序可用于家系研究，也可用于 较大样本量的病例-对照研究。对于已经完成 连锁分析的家系，可将疾病连锁区间及附近的 DNA区域或外显子序列进行捕获后进行测序 • 相比全基因组测序更加经济、高效，但由于捕 获技术本身的局限性，也不能100%检测所有 的外显子或目标区域
• 家系分析变异筛选结果示例
– case common missense/stop/coding_change/frameshift/splice/ ncRNA snps NOT in family controls, – with 1000genomes(ALL & ASN) and ESP6500 frequency <16%(MAF<0.16), – compared against SKLMG sequenced controls & cases
• 实践显示，多种不同软件共同识别的变异 有更高的可靠性，因此有建议使用 consensus calls
第五步：变异注释
• 帮助预测变异的生物学功能或意义 • 运用 Annovar、SeattleAnnotation、 GenomeTrax等工具对每一变异筛查dbSNP、 1000genomes、PolyPhen、SIFT、 ESP 、 HGMD、OMIM、KEGG Pathway、CNV、 DGV等数据库，评估表型或疾病风险
高度近视HM-SR8家系找到的一个突变
sampl eCoun sample chrom startPos endPos ref alt function gene exonicPos hetStatus t M17811;M1 CA13:NM_198584:ex 8616305 frameshif 3 7812;M242 8 86163057 CT CA13 on2:c.126_127del:p.D het;het;het 8 t deletion 97 42fs, quality depth 3103.73; 143;121; 1848.73; 250 4975.73
显性 隐性
过滤正常人数据库 dbSNP, 1000 Genome Project, ESP, in-house数据库，
基因纯和或复合杂合位点
过滤正常人数据库
对蛋白功能影响的预测
dbSNP,1000 Genome Project, ESP, in-house数据库， 如：去除高频突变
变异筛选结果示例（ SNP&Indel）
• 非编码改变的影响预测准确性还相对有限， 通过数量性状定位或关联分析的文献数据
来预测是目前最为有效的方法
第六步：变异筛选 （举例，并非唯一方案）
找出患者共有而正常对照没有的变异 去除不影响功能的变异，如同义变异、基因间区、内含子区的变异， 保留Missense, nonsense, splice site, frameshift, cds-indel等变异
（二）
数据分析基本流程
分析目的：变异检测
• DNA变异常见类型：
– 单核苷酸多态（SNP）和短片段插入缺失 （Indel） – 缺失（deletion） – 插入（insertion） – 倒位（ inversion） – 易位（translocation） – 拷贝数变异 （CNV）
NGS数据分析基本流程
利用外显子组测序检测一个家 系突变的分析方法介绍
郑宇
2014-12-18
提纲
• NGS 测序简介 • 分析基本流程
– – – – – – 质量过滤 比对 寻Байду номын сангаас变异 变异质量过滤 变异注释 家系或群体样本综合分析过滤
（一）
NGS测序简介
DNA 测序简介
• 针对单个小扩增片段进行的Sanger测序(1-1000bp)
第三步：将序列比对到参考基因组
• 目的：对测出的序列片段进行定位，看位 于参考基因组上的哪个位置
• 生成SAM或BAM（二进制）文件
– 比对工具如：BWA，bowtie2，Illumina的 Hiseq Analysis Software ，SOAP等，我们用的 BWA mem
Bam文件用igv工具展示示例
SNP & Indel
突变注释（dbSNP，1000g，ESP6500， DGV等，位置，功能，保守性，通路， 蛋白互作网络…）
突变筛选，可视化 生成分析结果报告 突变验证，提送临床医生，生产诊断报告
SV
第一步：原始下机数据bcl文件转换 成fastq文件
FASTQ file format
FASTQ 文件示例，该文件包含一条序列：
@SEQ_ID GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT + !''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65
A FASTQ文件将每条序列用四行表示： 第一行 以“@’”打头，后跟着序列ID，可加上序列描述（类似于FASTA文件的标 题行）； 第二行 是序列内容； 第三行 以‘+’ 打头，后面的序列ID和描述可有可无； 第四行 是第二行序列每个位点的质量值，字符个数必须与第二行完全相同。 以hiseq2000为例，一个run可产生6G reads（100bp 读长）
实验室操作（DNA提取，文库制备…）
测序（Illumina/SOLiD…）
加测/重测数据
质量差或 产量不足
质量评估(数据产量和质量)， 并去除低质量碱基 序列拼接组装（比对，去重，indel重 新比对，碱基质量重新计算）
测序比对率，覆盖度，深度评估
覆盖度不够
变异检测（SNP，Indel…；体细胞， 生殖细胞)
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• http://www.openbioinformatics.org/annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
• Integrated Genomics Viewer (IGV)
（http://www.broadinstitute.org/software/igv/home ）
– 浏览大型基因组数据的高性能交互式视图 – 整合了NCBI refGene数据、hg19、hg18等不同 版本的人类参考基因组 – 可在本地交互式查看局部比对 – 可同时查看多个样本的比对，支持多种数据类 型
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
Variant Call Format (VCF) 是用于存储基因序列变异的特定文本文件格式，该格式是随着 大规模基因分型和DNA测序而出现的，如千人基因组计划。它包含描述元数据的行，然后是数据 表头行，后面的数据行每行包含基因组中一个位置的信息（如变异信息）。
VCF（Variant Call Format）文件（示例）
（ http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices）
Snp&Indel生成VCF或者GVCF格式结果文件
VCF格式
vs.
GVCF格式
VCF 格式
##fileformat=VCFv4.0 ##fileDate=20110705 ##reference=1000GenomesPilot-NCBI37 ##phasing=partial ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data"> ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth"> ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency"> ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele"> ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129"> ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership"> ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10"> ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data"> ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality"> ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype"> ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth"> ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality"> #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3 2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,. 2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3