酿酒酵母细胞固定化研究

由表 １ 可见，随着 Ｃａ２＋ 浓度的增大，固定化酵母 强度增强，而发酵液的残糖量及酒精度没有明显差 异。但当 Ｃａ２＋ 浓度过大时 （２．６ｍｏｌ／Ｌ），残糖量有升 高趋势。表明 Ｃａ２＋ 浓度是决定固定化酵母机械强度的 重要因素，在一定范围内对固定化酵母的发酵特性无 显著影响，但当浓度过大时，会使固定化酵母颗粒的
表 ４ 固定化条件的优化实验方案及结果分析 Ｔａｂｌｅ ４． Ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｏｃｅｓ ｓ ｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｓ ｕｌｔｓ ａｎａｌｙｓ ｉｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂ－
ｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａ 第 １ 次循环发酵液糖度变化
处理号 Ａ 氯化钙浓度 ／ Ｂ 海藻酸钠 Ｃ 固定温 空列 耗糖
取 １．００ｇ 酿酒干酵母，用 ５０ｍＬ 浓度 ２％的蔗糖溶 液在 ３０℃恒温活化 ３０ｍｉｎ，备用。 １．２．２ 海藻酸钠—酵母菌悬液的制备
用 ５０ｍＬ 蒸馏水加热溶解一定量海藻酸钠，按试 验设计浓度配制所需海藻酸钠溶液，降温至 ３０℃，将 活化酵母液与海藻酸钠溶液充分混合均匀，形成海藻 酸钠—酵母菌悬液。
残糖量 ／％
２．６ ２．６ ２．５ ２．４ ３．５
酒精度 ／％ （ｖ／ｖ） ６．５ ６．４ ６．４ ６．７ ６．１
固定化酵母强度
＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
注：“＋”软，“＋＋”硬，“＋＋＋”较硬 （以下表中同）。
２．１．２ 海藻酸钠浓度对固定化酵母发酵特性的影响 固定氯化钙浓度为 ２．０ ｍｏｌ／Ｌ 时，海藻酸钠浓度
由表 ３ 可以看出，随着固定温度的变化，发酵液 的残糖量及酒精度均无显著变化，固定化酵母颗粒强 度的差异也不明显。表明固定温度对固定化酵母的特 性无显著影响。由工业化生产的角度考虑，选取 ２０℃ 为酵母细胞固定时的温度。
２００６ Ｎｏ．２
·１４· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１５５
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
外观耗糖率 ＝ 发酵液初始糖度 － 发酵结束发酵液残糖度 ×１００％ 发酵液初始糖度
固定酵母颗粒强度测定： 感官法。 ２ 结果分析 ２．１ 酵母细胞固定化条件试验分析 ２．１．１ 氯化钙浓度对固定化酵母发酵特性的影响
海藻酸钠浓度为 ３．０％，氯化钙浓度设置为 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ、０．８ ｍｏｌ／Ｌ、１．４ ｍｏｌ／Ｌ 、２．０ ｍｏｌ／Ｌ、２．６ ｍｏｌ／Ｌ ５ 个梯度，发酵温度 ２８℃、ｐＨ３．８、时间 １１ｄ，分别对酵 母细胞进行固定化。固定化酵母的发酵特性见表 １。
１ 材料与方法 １．１ 试验材料
酿酒干酵母：广东丹宝利酵母有限公司；海藻酸 钠：化学纯，上海化学试剂采购站；无水氯化钙、蔗 糖：化学纯，西安化学助剂厂；恒温培养箱：上海福 玛实验设备有限公司； 电子恒温水浴锅：上海智城分 析仪器制造有限公司； １０ｍＬ 一次性注射器及 １１＃ 注 射针头：医用级，市售。 １．２ 酵母细胞固定化工艺流程 １．２．１ 酿酒干酵母的活化
通透性降低，影响其发酵。Ｃａ２＋ 浓度为 ２．０ ｍｏｌ／Ｌ 时， 固定效果最为理想。
表 １ 氯化钙浓度对固定化酵母特性的影响 Ｔａｂｌｅ １． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｏｎ ｉｍｍｏ－
ｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓ ｔ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
氯化钙 ／ （ｍｏｌ·Ｌ－１） ０．２ ０．８ １．４ ２．０ ２．６
Ｋ３
７０．３
极差 Ｒ
３．６７
３
１
２
６８
７１．７
７１．７ ７２．０
７４．７
７２．３ ７２．３
７０．０
７２．３ ７２．０
４．６７
０．６７ ０．３３
显著性
＊
影响主 次顺序
＊＊ Ｂ＞Ａ＞Ｃ
优组合
Ａ２Ｂ２Ｃ２ 或 Ａ２Ｂ２Ｃ３
注：＊ ０．０５ 水平显著，＊＊０．０１ 水平显著。
制成所需浓度的氯化钙溶液，将其置于设定温度的水 浴锅中，用注射器 （配有 １１＃ 注射针头） 将海藻酸 钠—酵母菌悬液点滴滴入氯化钙溶液中造粒，并恒温 维持 １ｈ，使酵母充分固定化。倾去上清液，用蒸馏水 冲洗固定化酵母 １ 次，然后重新置于 ０．０５ｍｏｌ／Ｌ 的氯 化钙溶液中平衡 ２４ｈ 后，备用。 １．３ 固定化酵母的批次发酵 １．３．１ 固定化酵母的发酵试验
（ｍｏｌ·Ｌ－１） 浓度 ／％ 度 ／℃
率／％
１
１ （１．５） １ （２．５） １ （１５） １
７１
２
１
２ （３．０） ２ （２０） ２
７５
３
１
３ （３．５） ３ （２５） ３
７０
４
２ （２．０）
１
３
２
７４
５
２
２
１
３
７６
６
２
３
２
１
７２
７
３ （２．５）
１
２
３
７０
８
３
２
３
１
７３
９
３
Ｋ１
７２．０
Ｋ２
７４．０
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ
表 ３ 固定温度对固定化酵母特性的影响 Ｔａｂｌｅ ３． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓ ｔ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
固定温度 ／℃
１０
２０
３０
４０
残糖量 ／％
２．５
wenku.baidu.com
２．４
２．７
２．７
酒精度 ／％ （ｖ／ｖ） ６．４
６．７
６．３
２００６ Ｎｏ．２
·１２· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１５５
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ
酿酒酵母细胞固定化研究
张 菡，杜双奎＊
（西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 ７１２１００）
摘 要：初步研究了海藻酸钙固定化技术在酿酒酵母上的应用。分析在不同条件下固定化酵母的发酵性能、机械强度，并对 固定化酵母与游离酵母的发酵力进行了分析。结果表明，酵母细胞固定化后，其使用寿命、发酵周期均有大幅度提高。海藻 酸钠的浓度 ３％，氯化钙浓度为 ２．０ｍｏｌ／Ｌ，固定化温度 ２０℃，酵母细胞的固定化效果最为理想。 关 键 词：酵母细胞；固定化；发酵 中图分类号：Ｑ８１４．２ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０２５４－ ５０７１ （２００６ ） ０２－ ００１２－ ０４
将固定化酵母置于 ２５０ｍＬ 浓度为 １０％ 、ｐＨ３．８ 的蔗糖溶液中，在 ２８℃进行发酵，定时记录发酵液的 糖度变化。 １．３．２ 游离酵母的发酵试验
取 １．００ｇ 酿酒干酵母，活化后，直接将其添加于 ２５０ｍＬ 浓度 １０％的蔗糖溶液中，在 ２８℃进行发酵，定 时记录发酵液的糖度变化，作为对照试验。 １．３．３ 批次发酵试验
在 氯 化 钙 浓 度 为 ２．０ ｍｏｌ／Ｌ， 海 藻 酸 钠 浓 度 为 ３．０％时，分别在 １０℃、２０℃、３０℃、４０℃ ４ 个温度水 平下固定酒用酵母 ， 发 酵 温 度 ２８℃ 、 ｐＨ３．８、 时 间 １１ｄ， 研 究 固 定 温 度 对 固 定 化 酵 母 发 酵 特 性 的 影 响 。 所得固定化酵母的颗粒特性及发酵特性见表 ３。
分别为 ２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％，发酵温度 ２８℃、ｐＨ３．８、时间 １１ｄ，研究海藻酸钠浓度对固定化 酵母发酵特性的影响，结果见表 ２。
表 ２ 海藻酸钠浓度对固定化酵母特性的影响 Ｔａｂｌｅ ２． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓ ｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｏｎ ｉｍｍｏ－
收稿日期：２００５－０８－１９；修回日期：２００５－１０－２６ 基金项目：西北农林科技大学校青年基金 （０８０３０１） 作者简介：张 菡 （１９７９－），女，在读硕士；杜双奎＊，通讯作者，主要从事发酵工程研究。
研究报告
中国酿造
２００６ 年 第 ２ 期
总第 １５５ 期 ·１３·
１．２．３ 酵母细胞的固定化 取一定量无水氯化钙，溶于 １５０ｍＬ 蒸馏水中，配
ｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓ ｔ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
海藻酸钠 ／％
２
３
４
５
６
残糖量 ／％
２．５
２．４
２．８
３．２
３．８
酒精度 ／％ （ｖ／ｖ） ６．５
６．７
６．３
６．３
５．９
固定化酵母强度 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
由表 ２ 可见，随着海藻酸钠浓度的增加，发酵液 的残糖量升高，酒精度下降，固定化酵母的强度差异 不显著。表明海藻酸钠是决定固定化酵母渗透性的重 要因素，当海藻酸钠浓度较低时，凝胶的相对渗透性 增强，有利于底物的进入和产物的排出，有利于酵母 的发酵作用。但若浓度过低会导致凝胶的网状结构过 大，酵母细胞易由包埋介质中泄漏出来，无法有效地 起到固定作用［４－５］。海藻酸钠浓度为 ３．０％时，固定化酵 母具有理想的发酵特性和机械强度。 ２．１．３ 固定温度对固定化酵母特性的影响
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｙｅａｓｔ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ｗｅｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ： ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ３％ ， ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ２．０ ｍｏｌ／Ｌ， ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２０℃． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＺＨＡＮＧ Ｈａｎ， ＤＵ Ｓｈｕａｎｇ－ｋｕｉ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉ－Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００ ， Ｃｈｉｎａ ）
细胞固定化技术是现代生物工程领域的重要内容 之一。其固定机理是将活酵母细胞高度密集于载体 上，并不断进行生长繁殖，形成高浓度的生物催化 剂，从而大大加快了反应速度，使反应器生产能力大 幅度提高。目前，酵母细胞固定化方法常用的有 ３ 种，第 １ 种是载体结合法；第 ２ 种是交联法；第 ３ 种 是包埋法。包埋法是目前微生物细胞固定化技术中最 为有效、常用的方法。固定化酵母克服了传统游离酵 母发酵工艺中酵母与产品分离困难、易流失、影响产 品质量等问题，且具有生长快、反应迅速、抗污染能 力强、可连续使用、产物分离方便等优点，目前越来 越广泛的应用于食品与发酵工业中。试验选用海藻酸 钠为包埋剂，以氯化钙为辅助材料，在不同条件下固 定酒用酵母细胞，分析海藻酸钠和氯化钙的浓度、固 定化温度对固定化酵母发酵特性的影响，分析固定化 酵母与游离酵母发酵性能的区别，优化酒用酵母细胞 的固定化条件，为酵母细胞的固定化提供参考依据。
待发酵液残糖量变化平缓后，取出固定化酵母， 用无菌蒸馏水清洗，在 ｐＨ２．８ 的溶液中浸泡 ４ｈ￣５ｈ， 去除杂菌。之后再次置于新配制的蔗糖 （１０％、ｐＨ３．８、 ２５０ｍＬ） 溶液中，在相同的发酵条件下重新进行发酵 试验，记录糖度变化和发酵批次数。 １．４ 分析方法
酒精度测定［１］ ：ＧＢ／Ｔ １５０３８—９４ 酒精计法。 总糖测定［１］ ：ＧＢ／Ｔ １５０３８—９４ 直接滴定法。 外观耗糖率计算［２］ ：
６．３
固定化酵母强度 ＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋＋
２．３ 固定化酵母与游离酵母发酵性能的比较 在相同的发酵条件下，固定化酵母与游离酵母 ３
次循环发酵的糖度变化曲线见附图。
２．２ 酵母细胞固定化条件的优化 在单因素试验研究的基础上，选取氯化钙浓度 （Ａ）、
海藻酸钠浓度 （Ｂ）、固定温度 （Ｃ） 作为考察因素， 以耗糖率为试验指标，设置 ３ 因素 ３ 水平正交试验， 实验方案及结果见表 ４。