激光扫描共聚焦显微镜ppt课件
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共聚焦激光扫描PPT课件
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4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
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5
Wide-field microscopy
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6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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13
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14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
.
10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
.
7
Confocal microscopy
.
8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
10
11
12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
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13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
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15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光扫描共焦显微镜技术共48页PPT
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
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只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
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目录
01 原理 02 应用
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01 原理
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荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
共聚焦激光扫描显微术ppt课件-PPT精选文档
思考题： 1. 结合1-2个例子，简述激光共聚焦扫描显微
镜技术在生物医学中的应用。
名词解释：
1. 荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP)
2. 光笼锁（caged）化合物技术
Thanks for your attention!
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific
sea anemone relative Discoma Striiata 中分 离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名 为DsRed。
五、在神经生物学的应用
1.神经细胞参数测定及三维重建 • 细胞外形 • 浦肯野氏细胞及其突起的投射 • 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 • 神经骨架重组的研究
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束
2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、 伪彩、值等）。
3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对 物镜焦平面是共轭的。
宽场照明显微镜和共聚焦图象比较
笼锁神经递质、调质及抗体
例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨
甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电
极导入法，膜片钳全细胞方式导入法
CLSM的优点
1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰
转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内 有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜×100倍)
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
细胞膜流动性研究
总结词
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
神经元突起研究
总结词 详细描述
细胞骨架结构研究
总结词
详细描述
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜的未 来发展与挑战
技术创新与改进
分辨率提升 高速成像 多维成像
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
确的依据。
药物研发
利用激光扫描共聚焦显微镜观察 药物对细胞的作用和影响，为新
药研发提供实验支持。
生物科学研究
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 生物科学研究，探索细胞和分子
层面的生命活动规律。
实验伦理与法规
动物实验伦理 数据处理与隐私保护 法规遵循
WATCHING
激光扫描共聚焦显微 镜教学课件
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜实验技术 • 激光扫描共聚焦显微镜实验案例 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与挑战
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜简介
定义与特点
定义 特点
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑；
01
样品选择
02 样品预处理
03 载玻片准备
显微镜设置
光源选择
物镜选择
滤色片配置 扫描速度与分辨率设置
图像采集
校准
。
采集参数设置
多区域采集 实时预览
数据分析
图像处理
共聚焦激光扫描荧光显微镜简介以及原理ppt课件
屏障滤光片(激Fra bibliotek光滤器 检流计
物镜
30
谢谢！
31
27
• 通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴 重叠就可形成一个完整的三维图象
28
• 切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径 影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定 为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。
29
光电倍增管 扫瞄装置
共焦针孔
空气冷却氩激光器
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
4
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重 荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重 叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
6
• Nikon的 Eclipse C1 Plus
7
• 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60x ， 100x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 • 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。 • 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。
物镜
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谢谢！
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• 通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴 重叠就可形成一个完整的三维图象
28
• 切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径 影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定 为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。
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光电倍增管 扫瞄装置
共焦针孔
空气冷却氩激光器
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
4
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重 荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重 叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
6
• Nikon的 Eclipse C1 Plus
7
• 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60x ， 100x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 • 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。 • 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。
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• 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium bromide (INT)
12
CTF
CTC的微生物细胞还原 无色非荧光分子 红色荧光分子
CTC CTF
Viable cell
13
Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC
24
25
Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy
Fluorescent microscopy
Confocal microscopy
显示的是一个光学切面
Fluorescent microscopy
26
样品的3D-重建
27
激光扫描共聚焦显微镜主要功能
15
荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子
CFDA-SE
CFDA-SE
活性微生物细胞
活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于
微生物细胞内
16
4、膜电位（membrane potential）
工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位， 可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标
1. 带正电荷荧光探针 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 进入活性细胞
2. 带负电荷荧光探针 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol
DiBAC4(3) 进入死细胞
17
5、pH荧光探针
工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH 梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞 生理状态的一个评价标准
1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构
11
2、代谢活性(metabolic activity)
微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：
• 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)
• 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2tetrazolium bromide (MTT)
激光扫描共聚焦显微镜在微 生物研究中的应用
1
2
激光扫描共聚焦显微成像
CTC 染色
Baclight Live/Dead 染色
Baclight Live/Dead 染色
3
主要内容
1、分子荧光的形成 2、微生物研究中常用的荧光染料 3、共聚焦显微镜基本原理 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用
4
一、分子荧光的产生
2. Pranine
3. BCECF
18
一些常见荧光染料的激发与发射波长
Probe
Physiological Excitation (nm) Emission
function
(nm)
PI
Membrane
535
617
integrity
CTC
Met0-660
DiBAC4(3) Membrane
9
1、膜通透性(membrane integrity)
BacLight Live/Dead (PI/SYTO9)
PI
SYTO9
PI
PI SYTO9
PI
PI
SYTO9 PI
SYTO9 PI
PI
PI PI
PI SYTO9
Viable cell
Damaged cell
10
Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007
CTC 染色
CTC 染色
14
3、酯酶活性(esterase activity)
工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧 光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保 留于胞内
1. Fluorescein diacetate (FDA)
2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
1.1 分子荧光产生的条件
1. 基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至 激发态, 通常为π→π*、n→π*跃迁
2. 激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放 能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）
5
6
1.2 影响荧光的因素
1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都 可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
20
3.2 共聚焦成像原理
21
22
3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较 1. More Color Possibilities 2. Less Cross Talk（串色）
23
3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact （光学切片） 4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三维重构） 5. Improved Resolution（更高的分辨率）
493
516
potential
Rh123
Membrane
507
529
potential
FDA
Esterase
492
517
CFDA-SE
activity
SYTO9
Membrane
488
permeant
509
19
三、激光扫描共聚焦显微镜
3.1 激光扫描共聚焦显微镜的组成
显微镜光学系统 扫描装置 激光光源 检测系统
键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2. 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换 去活的几率增加 3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严 格控制
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二、微生物研究中常用的荧光探针
荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类
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微生物研究中主要的荧光探针：
1、膜通透性（membrane integrity） 2、代谢活性(metabolic activity) 3、膜电位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它
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CTF
CTC的微生物细胞还原 无色非荧光分子 红色荧光分子
CTC CTF
Viable cell
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Example 2: Staining of Streptomyces sp. with CTC
24
25
Example 3: Comparison of confocal microscopy with fluorescent microscopy
Fluorescent microscopy
Confocal microscopy
显示的是一个光学切面
Fluorescent microscopy
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样品的3D-重建
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激光扫描共聚焦显微镜主要功能
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荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子
CFDA-SE
CFDA-SE
活性微生物细胞
活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于
微生物细胞内
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4、膜电位（membrane potential）
工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位， 可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标
1. 带正电荷荧光探针 Rhodamine 123 (Rh123); DiOC6(3) 进入活性细胞
2. 带负电荷荧光探针 Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol
DiBAC4(3) 进入死细胞
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5、pH荧光探针
工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH 梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞 生理状态的一个评价标准
1. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构
11
2、代谢活性(metabolic activity)
微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：
• 5-Cyano-2.3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)
• 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2tetrazolium bromide (MTT)
激光扫描共聚焦显微镜在微 生物研究中的应用
1
2
激光扫描共聚焦显微成像
CTC 染色
Baclight Live/Dead 染色
Baclight Live/Dead 染色
3
主要内容
1、分子荧光的形成 2、微生物研究中常用的荧光染料 3、共聚焦显微镜基本原理 4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用
4
一、分子荧光的产生
2. Pranine
3. BCECF
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一些常见荧光染料的激发与发射波长
Probe
Physiological Excitation (nm) Emission
function
(nm)
PI
Membrane
535
617
integrity
CTC
Met0-660
DiBAC4(3) Membrane
9
1、膜通透性(membrane integrity)
BacLight Live/Dead (PI/SYTO9)
PI
SYTO9
PI
PI SYTO9
PI
PI
SYTO9 PI
SYTO9 PI
PI
PI PI
PI SYTO9
Viable cell
Damaged cell
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Example 1. Staining of Streptomyces sp. with BacLight live/dead L7007
CTC 染色
CTC 染色
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3、酯酶活性(esterase activity)
工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧 光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保 留于胞内
1. Fluorescein diacetate (FDA)
2. 5(6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)
1.1 分子荧光产生的条件
1. 基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至 激发态, 通常为π→π*、n→π*跃迁
2. 激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放 能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）
5
6
1.2 影响荧光的因素
1. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位
整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都 可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
20
3.2 共聚焦成像原理
21
22
3.3 激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较 1. More Color Possibilities 2. Less Cross Talk（串色）
23
3. Optical Sectioning of Objects Without Physical Contact （光学切片） 4. Three-Dimensional Reconstruction of Specimen （三维重构） 5. Improved Resolution（更高的分辨率）
493
516
potential
Rh123
Membrane
507
529
potential
FDA
Esterase
492
517
CFDA-SE
activity
SYTO9
Membrane
488
permeant
509
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三、激光扫描共聚焦显微镜
3.1 激光扫描共聚焦显微镜的组成
显微镜光学系统 扫描装置 激光光源 检测系统
键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2. 温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换 去活的几率增加 3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严 格控制
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二、微生物研究中常用的荧光探针
荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类
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微生物研究中主要的荧光探针：
1、膜通透性（membrane integrity） 2、代谢活性(metabolic activity) 3、膜电位(membrane potential) 4、酯酶活性(esterase activity) 5、pH 梯度(pH gradient) 6、其它