纤维素酶活力测定
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定（CMC糖化力法）1、定义：1克固体酶粉（或1毫升液体酶），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
2、原理：CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。
CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力和外切酶活力总和。
3、试剂：3.1 0.1mol/LpH﹦4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。
注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。
0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。
3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。
3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100 ml,混匀后存于冰箱内备用。
配后隔天使用。
4、仪器4.1 分光光度计4.2 恒温水浴，50℃4.3 25 ml具塞刻度试管5、分析步骤：5.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶酶活测定可编辑全文
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法纤维素是一种多糖，由若干葡萄糖分子通过β-1，4-糖苷键连接形成，具有结构特殊，难于降解的特点。
纤维素酶是能够降解纤维素的酶，广泛存在于微生物、植物和动物体内。
测定纤维素酶活力的方法因纤维素酶的种类及应用领域不同而有所区别，常用的方法包括酚-硫酸法、精胱酸法、流变法、荧光法等。
下面将介绍其中几种常用的方法。
一、酚-硫酸法酚-硫酸法是用于测定纤维素酶活力的经典方法之一、其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与试剂酚和硫酸反应产生可测定的颜色。
具体步骤如下：1.准备试剂：将1%酚（重量/体积）和10%硫酸（体积/体积）混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液（常用pH5.0的酸性缓冲液）。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的酚-硫酸试剂，充分混匀。
5.酚-硫酸试剂与还原糖反应产生胶体，表现为紫褐色。
通过比色计或分光光度计测定产生的胶体的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
二、精胱酸法精胱酸法是另一种常用的测定纤维素酶活力的方法。
其原理是：纤维素酶通过水解纤维素生成还原糖，而还原糖可以与精胱酸反应产生尿糖胺，尿糖胺与酚胺反应形成可测定的色素。
具体步骤如下：1.准备试剂：将精胱酸磷酸缓冲液（常用pH4.8）和4-氨基安替比林（ABTS）或3,3'-二氮杂联苯基过氧化物（DPPH）溶液混合，剧烈振荡。
2.取一个容量瓶，加入待测纤维素酶样品、适量的底物纤维素和适量的缓冲液。
3.进行恒温反应：将试剂和底物溶液在适当的温度下进行恒温反应。
4.终止反应：在特定的时间点，取出反应溶液，加入刚刚准备好的精胱酸试剂，充分混匀。
5.精胱酸试剂与还原糖反应产生色素，根据色素的吸光度，通过分光光度计测定产生的色素的吸光度，根据标准曲线或已知纤维素酶活力的对照样品，计算出待测样品的纤维素酶活力。
纤维素酶活力的测定
目的本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。
本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。
但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。
鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。
1950 年Reese提出了C1-Cx概念。
C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。
再由Cx最终催化形成还原性单糖。
而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)。
这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。
（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称CBH）。
这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。
（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。
将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定
原理：纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,在多种纤维素酶的协同作用下，植物细胞壁纤维素多糖被逐步降解为葡萄糖等还原糖。
在碱性环境下，3，5—二硝基水杨酸试剂与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，棕红色氨基化合物在540nm波长下具有最大吸收。
利用此原理测定540 nm处吸光度来测定酶活力。
试剂：
1mg/mL葡萄糖标准溶液:无水葡萄糖于80 °C烘至恒重，准确称取0.100g于烧杯中,加适量蒸馏水溶解,转入容量瓶中并蒸馏水定容至100 mL。
DNS溶液：酒石酸钾钠182 g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，苯酚5 g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，室温保存。
方法：
标准曲线的绘制：取6支20mL的试管按下表顺序依次加入各试剂
沸水中煮沸5min,流水冷却2min,各管中加12.5mL蒸馏水，定容到16mL，摇匀，放置20min 后，测定540nm处吸光度。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
纤维素酶活力的测定(sdu)
纤维素酶活力的测定高熹 168615140001一、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
二、实验试剂1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、实验器材1、紫外可见分光光度计2、胶头滴管3、水浴锅4、试管5、移液管四、实验步骤1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定（3,5-二硝基水杨酸法）姓名：高超年级：13级生科三班学号：201300140020同组者：樊晓航一，实验目的：1，学习掌握光度计的使用；2，学习用 3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力二，实验原理：1、3,5-二硝基水杨酸法测纤维素酶活力的原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维素二糖、葡萄糖等还原糖，能将 3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙色的氨基化合物，利用比色法测定还原物生成量来表示酶的活力。
2、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖的原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。
在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈橘红色，在 540nm 处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可以测定样品中还原糖的含量。
三，实验器材：器材; 比色管、水浴锅、电炉、分光光度计、容量瓶 100ml、烧杯、移液枪试剂 :1、3,5-二硝基水杨酸试剂,2、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液，溶解后成胶装液，静置过夜，使用前摇匀。
3、酶液（10ug/ml）四，实验步骤：1 ，标准曲线的绘制：在还原糖实验中已做曲线如下：2，. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。
其它操作同样品管。
3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml分别加入到三只比色管中标记为1，2，3，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml 显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm 测OD值4，测得的实验值如下;空白管：01号管：0.4262号管：0.4033号管：0.402五，试验结果分析：由三组平行实验结果，可用0.403带入计算得0.561mg/ml,所以在30分钟内生成的还原糖为14.022mg;酶活力计算公式为：（14.022×100）/30=46.74六，注意事项：1，在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。
纤维素酶酶活性测定试剂盒说明书
纤维素酶（cellulase ，CL ）/羧甲基纤维素酶活性测定试剂盒说明书微量法100管/48样注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义：CL （EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化羧甲基纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。
测定原理：采用蒽酮比色法测定CL 催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。
试剂的组成和配制：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体40mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入5mL 蒸馏水和45mL 浓硫酸充分溶解待用。
样品测定的准备：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL ）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g ）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min ，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
加样表和测定步骤：37℃振荡反应1h 后，90℃水浴15min （盖紧，防止水分散失），冷却后试剂名称 对照管 测定管 样本 50 50 试剂一（μL ） 90 试剂二（μL ） 370 370 蒸馏水（μL ）180908000g 25℃离心10min，取上清，得糖化液糖化液(μL)140 140试剂三(μL)260 260 混匀，90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，测620nm下吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。
实验八 纤维素酶活力测定实验
实验八纤维素酶酶活力的测定实验【实验目的】1、了解测定纤维酶活力及还原糖的原理。
2、掌握测定纤维酶活力及还原糖的方法。
3、获得部分纤维素酶。
【实验原理】纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。
它包括C1、C X酶及纤维二糖酶（β—葡萄糖苷酶）。
作用方式：C1酶C X酶纤维二糖酶天然纤维素-----→直链纤维素----→纤维二糖---------→葡萄糖其中C1酶是使天然纤维素晶体都分链，起一个分离作用和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素。
C X酶不能水解天然纤维素，而能水解直链纤维素的β-1，4-葡萄糖酶键，生成纤维二糖，纤维二糖再经过纤维二糖酶水解成为葡萄糖。
本法以滤纸和羧甲基纤维素钠盐作为底物加入一定量的酶液，在一定的条件下起作用，然后观察滤纸的溃崩情况来判断C1酶活力的大小，同时，测定CMC 水解液中还原糖的含量用来表示C X酶活力的大小。
用羧甲基纤维素钠盐(CMC)作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS法测定还原糖的含量，从还原糖的数量来求得酶活力的大小。
纤维素分子是由β-葡萄糖从1，4键相连的长链，由于纤维素的分子间氢键数目极其多，因此不溶于水，在纤维素分子中β-葡萄糖上第2，3及5个碳原子都有一个游离的羧基，如羧基上的氢被羧甲基取代，由于羧基有着很强的亲水性，因此，CMC就能溶于水而成为胶状溶液。
羧甲基纤维素无论在结构上或是在性质上都很大程度地不同于纤维素。
因为它溶于水。
所以，非常容易被纤维素酶水解，在相同的条件下，同一纤维素酶水解CMC所产生的还原糖远大于水解纤维素所产生的还原糖，因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的数值总是比较高的，所以CMC的酶活力只能供参考。
测定还原糖的方法很多，只是采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，比较简便，3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，在一定还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。
四种纤维素酶酶活测定方法的比较
四种纤维素酶酶活测定方法的比较一、本文概述纤维素酶是一类能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，它们在生物降解纤维素以及纤维素类物质的转化利用中发挥着至关重要的作用。
由于纤维素酶在纺织、造纸、生物燃料、食品工业等多个领域的广泛应用，对其酶活性的准确测定就显得尤为重要。
本文旨在比较四种常用的纤维素酶酶活测定方法，包括滤纸酶活法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活法、对硝基苯酚纤维二糖法（pNPC）和荧光底物法，以期为读者提供一个全面而深入的理解，帮助研究者根据实验需求选择合适的测定方法。
本文将首先简要介绍纤维素酶的重要性和应用领域，然后详细阐述这四种酶活测定方法的原理、操作步骤、优缺点以及适用范围。
通过对比这些方法的灵敏度、准确性、重现性、操作简便性等方面，我们将为读者提供一个清晰的方法选择指南。
本文还将讨论影响酶活测定准确性的因素，并提出相应的改进措施，以期提高纤维素酶酶活测定的准确性和可靠性。
我们将对纤维素酶酶活测定方法的未来发展趋势进行展望，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
二、方法介绍纤维素酶是一种能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，其酶活测定对于了解纤维素酶的性质、优化酶的生产工艺以及评估其在各种工业应用中的效率至关重要。
目前，常见的纤维素酶酶活测定方法主要包括滤纸酶活测定法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法、还原糖法以及荧光底物法。
滤纸酶活测定法：此方法是基于纤维素酶对滤纸的水解能力。
在一定条件下，纤维素酶将滤纸水解成还原糖，通过比色法或滴定法测定还原糖的含量，从而推算出纤维素酶的活性。
该方法操作简单，但受滤纸质量、实验条件等因素影响，结果可能存在一定误差。
羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法：该方法以羧甲基纤维素钠为底物，通过测定酶解后释放的还原糖量来计算纤维素酶的活性。
该方法具有底物纯度高、反应条件易控制等优点，因此在许多研究中得到广泛应用。
然而，CMC与天然纤维素的结构差异可能导致测定的酶活与实际应用中的酶活不完全一致。
纤维素酶活力的测定实验报告
纤维素酶活力的测定实验报告1.实验目的本实验旨在通过测定纤维素酶的活力，了解其在不同条件下的活性及作用效果，为进一步研究纤维素酶的应用提供实验依据。
2.实验原理纤维素酶是一种能够分解纤维素为可溶性糖的酶，其活性高低直接影响着纤维素分解的效果。
本实验采用DNS法测定纤维素酶活力，该方法具有操作简便、准确性高等优点。
具体原理如下：在一定条件下，纤维素酶与底物反应产生可溶性糖，其含量可用DNS试剂进行显色反应，根据吸光度值计算可溶性糖的含量，进而求得纤维素酶活力。
3.实验步骤（1）实验准备：准备5mmol/LCMC-Na溶液、10mg/mLDNS溶液、100mmol/LNaOH溶液、纤维素酶溶液；取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、1mL 酶液、2mLNaOH溶液，混合后摇匀。
（2）设置对照：取2mLDNS溶液、1mLCMC-Na溶液、2mLNaOH溶液混合后摇匀，作为对照溶液。
（3）反应：将酶液和对照液分别加入两支试管中，于50℃水浴中恒温20分钟。
（4）显色：取出试管，分别加入1mLDNS溶液，摇匀后再次置于50℃水浴中恒温20分钟。
（5）比色：取出试管，冷却至室温，分别以空白试剂为参比，于540nm波长处测定各管吸光度值。
4.实验结果根据实验数据可知，纤维素酶活力为20.33U/mL，对照液吸光度值为0.65。
5.实验分析通过实验结果可知，本实验条件下得到的纤维素酶活力为20.33U/mL，与文献报道值相符。
这说明本实验所选条件较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，实验过程中采用了DNS法测定可溶性糖含量，该方法具有较高的准确性，因此实验结果可靠。
6.实验结论本实验通过DNS法测定纤维素酶活力，得到了较为准确的实验结果。
这说明本实验所选条件和方法均较为适宜，能够反映纤维素酶的实际活性水平。
同时，本实验也为进一步研究纤维素酶的应用提供了实验依据。
在实际应用中，可根据具体需求调整实验条件和方法，以获得更为准确的实验结果。
实验七 DNS法测定纤维素酶活力
实验七DNS法测定纤维素酶活力
一、试剂耗材
实验共分为6组，在每组的实验台上需要配置以下试剂和耗材：
25mL比色管(容量瓶或离心管也可)10支；试管架1个；50mL容量瓶；移液枪（移液管）1000μL 1把；5000μL1把，对应枪头若干；DNS 溶液100mL；1mg/mL葡萄糖标准溶液100mL；0.5%羧甲基纤维素钠水溶液50mL，滴管数支，烧杯100mL2个。
公用仪器设备：电子天平，分光光度计(2台以上)，恒温水浴锅
二、需要配置的溶液
1.DNS溶液：称取10g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g酒石酸钾钠和500mL水，加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠0.5g，待全部溶解后冷却，定容至1000mL，储存于棕色瓶中，放置一周，用前过滤分装。
2.pH 4.5 0.1mol/L乙酸乙酸钠缓冲液配置：（1000毫升）参考缓冲液配置手册
3.1mg/mL葡萄糖标准溶液:称取1g葡萄糖,用蒸馏水溶解,并定容到1000mL.分装
4.0.5%羧甲基纤维素钠溶液：用00.1mol/LpH 4.5的乙酸乙酸钠缓冲液配置。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为 5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖 1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠 1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为 5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸 1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离 5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚 2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取 5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离 5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至 5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取 2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入 2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取 2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入 2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×ｔ式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD?Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
实验纤维素酶活力的测定
实验 纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水酸法）一、实验目的掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水酸法测定纤维素酶活力的法。
二、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。
三、主要仪器与试剂(一)实验仪器1. 25mL 比色管2. 722型分光光度计3. 滴管4.水浴锅5.移液枪6.电炉 (二)、试剂1. 3,5-二硝基水酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水酸，溶入200mL 蒸馏水中，加入20g 分析纯氢氧化钠，200g 酒酸钾钠，加水至500mL ，升温溶解后，加入重蒸苯酚2.0g ，无水亚硫酸钠0.50g 。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL 。
存于棕色瓶中，放置一后使用。
2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg ，溶解后定容至100mL ， 此溶液含葡萄糖1.00mg/mL 。
5. 纤维素酶液：将0.05g 酶溶解定容至50 mL ，从中取出1.0mL 再定容至100mL ，待检测用。
（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 四、实验步骤1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL 比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL ，加3.5-二硝基水酸显色剂3mL ，在沸水浴中煮沸显色10min ，冷却，加蒸馏水21mL ，摇匀。
以空白管调零，在550nm 处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg 数为横坐标，绘出标准曲线。
序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液 0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.0 3,5-二硝基水酸 3.03.03.03.03.03.0实验操作 沸水浴加热10min ，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定吸光度A 550nm0.02.空白管的测定： 在2支25mL 试管中各加入1.0mL 酶液，沸水浴5min ，冷却后加3.0mL 0.5%CMC-Na ，与样品管同时放入50℃水浴30min 。
(完整版)纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
实验七DNS法测定纤维素酶活力
实验七D N S法测定纤
维素酶活力
Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】
实验七 DNS法测定纤维素酶活力
一、试剂耗材
实验共分为6组，在每组的实验台上需要配置以下试剂和耗材：
25mL比色管(容量瓶或离心管也可)10支；试管架1个；50mL容量瓶；移液枪（移液管）1000μL 1把；5000μL1把，对应枪头若干；DNS 溶液100mL；
1mg/mL葡萄糖标准溶液100mL；%羧甲基纤维素钠水溶液50 mL，滴管数支，烧杯100 mL 2个。
公用仪器设备：电子天平，分光光度计(2台以上)，恒温水浴锅
二、需要配置的溶液
溶液：称取10g 3，5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g 酒石酸钾钠和500mL 水，加热溶解后再加入重蒸酚2g、无水亚硫酸钠，待全部溶解后冷却，定容至1000mL，储存于棕色瓶中，放置一周，用前过滤分装。
L乙酸乙酸钠缓冲液配置：（1000毫升）参考缓冲液配置手册
3. 1mg/mL葡萄糖标准溶液:称取1g葡萄糖,用蒸馏水溶解,并定容到1000mL.分装
4. %羧甲基纤维素钠溶液：用L pH 的乙酸乙酸钠缓冲液配置。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
山东大学实验报告2011年4月20日
姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105
一、实验目的
1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法
2、巩固使用分光光度计
二、实验原理
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。
由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。
三、实验器材
（1）722型分光光度计（2）恒温水浴
（3）沸水浴锅
（4）电炉子
（5）剪刀
（6）分析天平（7）试管架
（8）胶头滴管
（9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球
四、实验材料
（1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）；
（2）3、5—二硝基水杨酸显色液；
（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；
（5）蒸馏水。
五、实验操作
1.空白管的测定：
1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC；
2.样品管测定：
取三支比色管，分别加入0.5%CMC 3毫升，酶液1毫升,混匀后与空白管一起于50℃水浴锅中水浴30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加蒸馏水定容至25毫升，混匀，与标准曲线同时于550nm处测OD 值。
3.标准曲线绘制：
取6只25ml比色管，分别吸取0，0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于,6支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml。
在550nm处比色测其OD值。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
4.计算酶活力：
在上述条件下，每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。
N ×OD值对应的葡萄糖量
纤维素酶活力单位＝———————————
`30×1
N---酶液的稀释倍数
30――糖化所用时间
１――反应酶液毫升数
六、注意事项
1.实验中由于比色管中溶液量过多，若用旋窝搅拌器混匀，可能使溶液溅出，可使用保鲜
膜，将其覆盖在比色管口，上下摇动比色管，进行混匀；
2.分光光度计使用前应进行预热30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，应使试样室盖
打开，此时光门自动关闭，以保护光电管；
3.使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避
免对比色管光滑一面造成磨损。
且测量时，不可以其磨砂面正对光源；
4.在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测
液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影响。
七、实验结果
(一)实验数据统计
(二)图表分析
根据图表曲线拟合，由标准葡萄糖光吸收曲线所得公式为y = 0.0005865x-0.0069，根据三个样品管的A（550nm）值可得其葡萄糖含量为743.2,750.0,741.5ug，平均得744.9ug。
N ×OD值对应的葡萄糖量
纤维素酶活力单位＝———————————=（100×744.9）/30=2483ug/mg×min
30×1
则每克纤维素酶（固体）的活力单位数=2483×1000=2.48×106 ug/g×min
八、分析讨论
本次实验中有以下方面可能导致误差：
1.定容到25ml后未充分混匀，导致上层溶液浓度偏低，进而影响OD值测量；
2.使用比色杯时未充分润洗，影响测定；
3.空白管在沸水浴时未完全失活，会导致调零基准不准确，影响实验结果；
4.放入沸水浴是没有保证时间相同，会直接导致实验误差；
5.定容时应使液体完全冷却，否则宜出现误差；。