纤维素酶活力测定

山东大学实验报告2011年4月20日

姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105

一、实验目的

1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法

2、巩固使用分光光度计

二、实验原理

纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。

三、实验器材

（1）722型分光光度计（2）恒温水浴

（3）沸水浴锅

（4）电炉子

（5）剪刀

（6）分析天平（7）试管架

（8）胶头滴管

（9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球

四、实验材料

（1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）；

（2）3、5—二硝基水杨酸显色液；

（3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；

（5）蒸馏水。

五、实验操作

1.空白管的测定：

1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC；

2.样品管测定：

取三支比色管，分别加入0.5%CMC 3毫升，酶液1毫升,混匀后与空白管一起于50℃水浴锅中水浴30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加蒸馏水定容至25毫升，混匀，与标准曲线同时于550nm处测OD 值。

3.标准曲线绘制：

取6只25ml比色管，分别吸取0，0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于,6支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml。在550nm处比色测其OD值。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。

4.计算酶活力：

在上述条件下，每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。

N ×OD值对应的葡萄糖量

纤维素酶活力单位＝———————————

`30×1

N---酶液的稀释倍数

30――糖化所用时间

１――反应酶液毫升数

六、注意事项

1.实验中由于比色管中溶液量过多，若用旋窝搅拌器混匀，可能使溶液溅出，可使用保鲜

膜，将其覆盖在比色管口，上下摇动比色管，进行混匀；

2.分光光度计使用前应进行预热30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，应使试样室盖

打开，此时光门自动关闭，以保护光电管；

3.使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避

免对比色管光滑一面造成磨损。且测量时，不可以其磨砂面正对光源；

4.在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测

液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影响。

七、实验结果

(一)实验数据统计

(二)图表分析

根据图表曲线拟合，由标准葡萄糖光吸收曲线所得公式为y = 0.0005865x-0.0069，根据三个样品管的A（550nm）值可得其葡萄糖含量为743.2,750.0,741.5ug，平均得744.9ug。

N ×OD值对应的葡萄糖量

纤维素酶活力单位＝———————————=（100×744.9）/30=2483ug/mg×min

30×1

则每克纤维素酶（固体）的活力单位数=2483×1000=2.48×106 ug/g×min

八、分析讨论

本次实验中有以下方面可能导致误差：

1.定容到25ml后未充分混匀，导致上层溶液浓度偏低，进而影响OD值测量；

2.使用比色杯时未充分润洗，影响测定；

3.空白管在沸水浴时未完全失活，会导致调零基准不准确，影响实验结果；

4.放入沸水浴是没有保证时间相同，会直接导致实验误差；

5.定容时应使液体完全冷却，否则宜出现误差；