光学显微镜的发展历史

光学显微镜的发展历史、现状与趋势

杨拓拓

(苏州大学现代光学技术研究所，江苏苏州215000)

1基本原理

显微镜成像原理及视角放大率

显微镜由物镜和目镜组成。物体AB 在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。

图1-1显微镜系统光路图

牛顿放大率公式：

f f x x ''=

'x 是像点到像方焦点的距离，x 是物点到物方焦点的距离。

根据牛顿放大率公式可得物镜的垂轴放大率为

'1'1'11--f f x ∆==

β 目镜的视觉放大率为：

'22250

f =Γ

组合系统的放大率为

'1f

'2'121250f f ∆

-=Γ=Γβ

显微镜系统的像方焦距

∆-=/'2'1'f f f '250

f =

Γ

显微镜系统成倒像轴向放大率 '2'1'2'1/f f x x =β

若物点A 沿光轴移动很小的距离，则通过显微镜系统的像点'2A 将移动很大的距离，且移动

方向相同。

显微系统的角放大率

'2'1'2'1/x x f f =γ

即入射于物镜为大孔径光束，而由目镜射出为小孔径光束。

显微镜的孔径光阑

单组低倍显微物镜，镜框是孔径光阑。

复杂物镜一般以最后一组透镜的镜框作为孔径光阑。

对于测量显微镜，孔阑在物镜的象方焦面上，构成物方远心光路。

显微镜的视场光阑和视场

在显微物镜的象平面上设置了视场光阑来限制视场。由于显微物镜的视场很小，而且要求象面上有均匀的照度，故不设渐晕光阑。

显微镜是小视场大孔径成像，为获得大孔径并保证轴上点成像质量，显微镜线视场不超过物镜的1/20,线视场要求：

1'120202β∆=≤f y

显微镜的分辨率和有效放大率

光学仪器分辨率

瑞利判据：两个相邻的“点”光源所成的像是两个衍射斑，若两个等光强的非相干点像之间的间隔等于艾里圆的半径，即一个像斑的中心恰好落在另一个像斑的第一暗环处，则这两个点就是可分辨的点。当物面在无穷远时，以两点对光学系统的张角可表示两分辨点的距离，其值为：

D /22.1λϕ=

显微镜的分辨率

分辨率是指在物体表面能够分解的最小间隔，两个发光点的分辨率为： NA U λλσ61.0sin n 222.1==

数值孔径（NA ）越大，分辨率越高。

显微镜的照明系统

临界照明 聚光镜应有与显微物镜相同或稍大的NA ，聚光镜前放置的可变光阑为聚光镜的孔阑改变孔阑大小，可改变进入物镜光束的孔径角，使之与物镜的NA 相适应。

图2-1临界照明光路图

特点：光源经过聚光镜所成之像与物平面重合，相当于物平面上置光源。

缺点：光源表面亮度不均匀或明显表现出灯丝的结构，影响显微镜的观察效果。 科勒照明

光源经聚光镜前组成像在照明系统的视场光阑上，聚光镜前组经过聚光镜后组成像于标本处，同时也把照明系统市场光阑成像在无限远处使之与远心物镜的入射光瞳重合。

图2-2科勒照明光路图

特点：把光源像成在物镜入瞳面上。

优点：可消除临界照明物平面上光照度不均匀的特点。

显微镜的工作距离

工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。

图2-3显微镜工作距离示意图

2 发明发现

公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像，这为镜头设计奠定了基础。1625年,斯泰卢蒂(FraneeseosteUuti)用,倍和10倍的放大镜(即单式显微镜)详细描绘出了蜜蜂各部分的图形,由意大利拾荆学院(AcademyofLynxEye)出版

图,这是有关显微镜研究的第一部著作。

第一架显微镜是荷兰眼镜工匠詹森父子在1590年前后制成的，但是并没有发

现显微镜的真正价值。由于初期的复式显微镜有严重的缺陷,荷兰的列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek,1632一1723)将其毕生精力放在发展单式显微镜上,并将它用于生物观察。这个传奇式人物终于成了显微镜学家和微生物学的开拓者。

3 发展阶段

英国科学家胡克自制显微镜，观察细小物体，1665年出版的《显微图谱》引入“细胞”概念；1835年，英国科学家提出“爱里斑”的概念。由于光的衍射，即使一个无限小的发光点在通过透镜成像时都会形成一个弥散的图案，即爱里斑；1873年，阿贝和亥姆霍兹各自独立发现正弦条件；1873年，阿贝从他的成像理论推导出关于显微镜分辨距离的公式，首先引用“数值孔径”；1878年，阿贝设计制成油浸显微镜，显微镜的分辨本领已达到其理论极限（μm）。

20世纪的前半个世纪里,光学显微镜有如下两个方面的发展，第一,为了观察生物标本的不同结构,提供多方面信息而设计成(或改良)一些特种显微镜；第二,仅为工作上的方便而设计成的一些特种显微镜。

暗场显微镜

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

图3-1暗视野照明方式

韦纳姆于1853年制成了简单的暗场聚光器,西登托普夫和齐格蒙第于1903年采用了从单向侧面照明的暗场观察方法。暗场显微镜的进一步发展是沿着改进照明器的方向前进的。1907年,西登托普夫制成一次反射抛物面型聚光器.他于1908年又为蔡司厂设计出心形面聚光器,同年蔡司厂还制成同心球面聚光镜,这些都是暗场显微镜中优良的聚光镜。

紫外显微镜

使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜研究单个细胞的组成与变化情况。

1904年科勒制成紫外显微镜，它的分辨本领虽有所提高，但不能达到.而且技术复杂，价格昂贵。1941年布伦伯格第一次描述了“紫外彩色转移显微术”，可用紫外显微镜制成无色透明标本的彩色图像。

偏光显微镜

偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。它的特点是光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。

图3-2偏光显微镜结构