生物选矿技术第三章新

第二节 选矿细菌的采集、培养与训化
• 包括以下5方面内容
• (1)细菌菌样的采集； • (2)细菌的分离、培养、纯化与鉴定； • (3)细菌的驯化；
• (4)细菌数量的测定；
• (5)细菌活性的测定。
第二节 选矿细菌的采集、培养与训化
1) 采集
地点
浸矿细菌可分布于土壤、水体及空气中，但
较为集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑
氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法
肉眼观察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将 被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕 色，最后产生高铁沉淀。 重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成 高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。 显微镜观察 观察细菌的形成，是否具有氧化 铁硫杆菌的形状特征。
说明：
• 浸矿细菌按其适宜的生长温度范围分为三个类型: 嗜中温细菌、中等嗜热细菌和极端嗜热细菌。
• (1)嗜中温细菌(Mesophile)：
• 最佳生长温度28一45℃，主要包括氧化硫硫杆菌、
氧化亚铁硫杆菌和氧化亚铁钩端螺菌。它们嗜酸、
严格好氧、无机化能自养，广泛存在于金属硫化 矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。
• (2)中等嗜热细菌(Moderate thermophile)：
• 最佳生长温度45-55℃ ，主要有硫化芽孢杆菌属,
已鉴定的有Sulfobacillus thermosulfidooxidans，
Sulfobacillus acidophilus，为无机化能兼性自养菌,
绝大多数需要酵母提取液或某种有机物为营养物. 有坚固的细胞壁, 能耐受较高的矿浆浓度和较高
上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯 种，要作平板分离。
平板分离
方法
把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。
在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平 板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划 线分散开。 将划好的线培养皿在25～30℃条件下恒温培养。
经10天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样
浸矿细菌种类及其主要生理特征
1.0-3.0 2.0-3.0 1.5-1.8
1.5-2.5
阳性
常见的浸矿自养菌 一、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans） 特征： ¶ 属原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、 硫化细菌科、硫杆菌属。 是专性化能自养菌，主要利用CO2为碳源，氮源为 NH4+,并吸收磷等无机营养来合成自身细胞。营好氧呼 吸，属革兰氏阴性菌。 广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺温泉 和沉积硫内 ，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑 水 (PH<4)中最为常见。 菌体呈杆状，它可以氧化亚铁为高价铁，也可将 硫代硫酸盐氧化为硫酸。
2）培养分离
步骤 1、配臵培养基 液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培
养基用于粗略地分离培养某种微生物。
•
浸矿自养菌的液体培养基是由水和溶在水中 的各种无机盐组成的，不能存在有机物。每种细 菌都有自己特有的培养基配方，这些配方是经过 研究者的试验研究之后得出的。例如氧化铁硫杆 菌培养基配方为 10克 0.4克 4克 1000ml MgSO4.7H2O FeSO4 CuCl2 0.5克 0.01克 0.25克
Байду номын сангаас
二、氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)
特征：
¶ 为圆头短杆状，通常以单个或成双、成短链状
存在，在菌体两端各有一油滴，可将培养基中的
硫溶入油滴之中再吸入体内进行氧化
¶ 其氧化元素硫的能力比氧化硫化合物的能力强， 可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐 5%的硫酸。生长温度：5-40℃；最适pH值：0.56.0. 能氧化元素硫，不能氧化Fe2+；
水。所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、
铀矿等有酸性矿坑水的地方。如，矿坑水的pH值
为1.5～3.5并呈棕色（说明有Fe3+ 存在），则很
可能存在氧化铁硫杆菌。
采集方法 取50-250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛 皮纸包扎好瓶口，臵于120℃烘箱灭菌20min，冷 却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取 酸性坑水。 另外，还可取矿坑岩壁上已氧化变为棕褐色 的潮湿矿块。 取样量以瓶中物总量不超过瓶容积的2／3为 宜。取样完后应立即贴上标签，标明取样时间和 地点。
自养化能菌的特征
靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得能
量，以空气中的CO2 作为碳源，并吸收培养基中的
氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞物质。
化能自养型细菌为还原CO2而需要的ATP和还原力[H]是通过 氧化无机底物(H2S、S、H2和Fe2+等)来实现的。
菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活
长.
中度嗜酸嗜热,革兰氏阴性菌，最适生长温度为40一 50℃。最适生长pH为2.在pH为1.5的时候仍能很好的生长.
• 四、钩端螺旋菌（Leptospirillum）
• 细菌形状为弧状或螺旋状，细菌长为0.9一3.5um，宽 为0.2一0.6um，革兰氏阴性。借助于单极鞭毛运动。 • 好氧;专性化能无机自养;通过将二价铁氧化成三价铁 获得能量,有机质的存在对其生长有抑制作用。不能 氧化硫和硫的其它还原性化合物。生长在极端酸性 (pHI.5一1.8)的环境中。嗜铁钩端螺旋菌（L. ferriphilum）能够生长在45℃，而氧化亚铁钩端螺 旋菌（L. ferrooxidans）生长在40℃以下。 • 在三价铁离子浓度高的条件下, Leptospirillum 属 菌株占浸矿微生物种群的优势, 是主要的铁元素氧化 者。
于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。
除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。
如氧化亚铁硫杆菌可将S或硫代硫酸盐氧化成硫酸和将 氧化亚铁氧化成高铁，氧化率达95－100％并放出能量。 2FeS2+7O2 +2H2 O→ 2FeSO4 + 2H2SO4 2FeSO4 + 2H2SO4 + 1/2O2 →Fe2（SO4 )3 +HO2 生成的Fe2（SO4 ）3是强氧化剂和溶剂，可溶解矿 石。如溶解铜矿（CuS），从中浸出铜元素。 CuS+ Fe2（SO4 ）3 → Cu SO4 + 2FeSO4 + S 溶出的CuSO4 液再加入铁屑、废铁等便可将铜臵换 出来。生成的FeSO4和S还可在这类细菌作用下再次氧化 成H2SO4和Fe2SO4，而循环使用。
浓度的金属离子, 因此该菌属在从硫化矿提取金
属特别是从难选冶金矿回收金属方面展现了潜在
的应用前景.
• (3)极端嗜热细菌 (Extreme thermophile)：
• 最佳生长温度60-85℃，多为古细菌，主要包括硫化 叶菌属。为兼性化能自养菌、嗜酸、极端嗜热, 可氧 化亚铁和元素硫。
• 其中，嗜中温菌和中等嗜热菌已成功应用于硫化矿的 生物氧化中，在低于45℃时以嗜中温菌为主;在45一 60℃范围内，以中等嗜热细菌为主;在40一45℃的范 围内可能有些重叠。 • 高温嗜热细菌在实验室已进行了扩大试验，但还未进 行大规模的工业应用。
• ¶ 含亚铁的液体培养基中，亚铁被氧化使培养基 由浅绿色变成红棕色，Fe3+水解成氢氧化物或铁
矾沉淀。在固体培养基上长成红棕色菌落。
• ¶ 用不含铁的液体培养基，则由于硫代硫酸盐氧 化生成硫酸，使培养基酸度提高。 • ¶ 可以氧化Fe2+、元素硫(So)和还原态硫化物。 • 生长温度：5-40℃；最适pH值：1.2-6.0
• 硫粉 • (NH4)2SO4 • KH2PO4 • 水
固体培养基
平板分离用的固体培养基，是在液体培养基
中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。
方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼
脂溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，
冷却至常温即制成固体培养基。
进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。
35℃恒温下，静臵培养（或振动培养）7～10天。
细菌生长繁殖使三角瓶中培养基的颜色由浅绿 变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀。 选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取 1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中， 同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。
按同样办法反复转移培养10次以上。每转移一
针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培
养，一般7天左右培养液就可变成红棕色。
将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如 此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。
2. 平板划线分离法
将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌 液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种 环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种 环面成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划 破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划 线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
第三章 选矿用微生物与浸矿工艺 第一节选矿用微生物
1、选矿微生物种类及生理生态特性
生物选矿工业用的微生物绝大多数为细菌， 迄今已报道的浸矿细菌至少遍布13个属，营养类 型从专性自养型到兼性自养型和异养型。
其中大部分属于自养菌，某些异养菌也可以 溶浸金属矿物，在生产中得到实际应用的主要是 自养类微生物。
次只需1～2滴，接种量逐渐减少而所培养的细菌
却越来越活跃，只需培养3～5天就可把培养基中
的Fe2+氧化为Fe3+。
培养的机制 在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死
淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高
浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖， 其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充 分繁殖，活性越来越大。
• 2、冶金微生物的一般性特征 • 目前所研究的与采矿有关的微生物都具有几个共同的生理特征: • ①营养类型一般属于化能无机自养型，以CO2为碳源。尽管主要 的采矿微生物之间对二氧化碳的固定效率存在着差异，但它们都 能固定二氧化碳。只不过固定效率较低的种类往往需要较高浓度 的二氧化碳或少量的酵母提取物才能迅速地生长. • ②能够利用亚铁离子或还原性无机硫(或二者都能利用)作为电子 供体，一般以O2为电子受体;尽管某些采矿微生物能够使用Fe3+ （并不是氧气)作为电子受体，但它们通常在氧气充足的条件下 生长得更好。 • ③大多数种能够生长在极端酸性的环境中(pHI.4一2.0)，由于对 硫的氧化所形成的副产物为硫酸，因而如此，甚至对于那些仅仅 能够使用亚铁作为能源的采矿微生物来说，也能够生长在这种极 端酸性环境中。 • ④尽管不同种或同种内不同株系之间对金属的抗性存在着某些差 异，但它们通常都能耐受一定范围浓度的金属离子。At. ferrooxidans appears to be particularly resistant to metals and the bacterium has been reported to grow in medium containing Co2+ (30 g/l), Cu2+ (55 g/l), Ni2+ (72g/l), Zn2+ (120 g/l), U3O8 (12 g/l) and Fe2+ (160 g/l).
加水 装待灭 菌物品 加盖 加热 灭菌时间到后 断电源 压力降为零 开箱取物
2)培养分离
步骤
2、富集所需菌种
配好的液体培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌
操作下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。
每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取
1～5mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞臵于20～
培养基的制备步骤
原料（药品）称量
混合溶解（加热）
定容
调整PH
过滤
分装容器
消毒或灭菌
保温实验
备用
高压蒸汽灭菌 1、原理 利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌 锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能 溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点 增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白 质凝固变性而达到灭菌的目的。 一般培养基用0.1Mpa，121.5℃,15～30min 2、步骤
三、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus，简称A.caldus)
1994年首次报导,属微生物中原核生物界、化能营养原 核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。 主要以S为能源物质，也可以利用硫代硫酸钠以及连四 硫酸盐为能源，以空气中的CO2为碳源自养生长;不能利用有 机物为唯一营养物质异养生长;酵母膏，蛋白膝等有机物对 它的生长有一定的抑制作用;少量的葡萄糖可以刺激它的生