酶工程实验讲义最终稿

实验二 酶促反应进程曲线的制作
实验目的
❖学会制作酶促反应的进程曲线。 ❖掌握可见分光光度计的使用。
实验原理
❖ 所谓进程曲线是指酶 促反应时间与产物生 成量(或底物减少量) 之间的关系曲线。它 表明了酶促反应随反 应时间变化的情况。
❖ 测定酶活力应该在进 程曲线的初速度时间 范围内进行。
实验器材
实验试剂
❖0.01mol/L HAC-NaAC缓冲液 ❖结晶硫酸铵 ❖石英砂
实验步骤
❖ 1.紫贻贝预处理: 将买来的 紫贻贝用过滤的海水饥饿处 理4~8小时。
❖ 2.解剖：戴上手套，将紫贻 贝解剖后，观察其消化腺的 位置。
❖ 3.匀浆：取紫贻贝消化腺， 用滤纸吸干后称重，加入1倍 体积预冷的缓冲液和石英砂 在研钵中完全研成浆状。静 置0.5h。
实验原理
❖ 酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，ACP）存 在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺 之中，能专一水解磷酸单酯键。
❖ 本实验选用紫贻贝消化腺中的酸性磷酸酯酶为 材料，磷酸苯二钠为底物。
❖ 磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生 成酚和无机磷，其反应式如下：
❖ 由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸 性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也 越多。
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
❖ 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲 反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反 应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷 钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试 剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的 量成正比例。
2．实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应 时间的准确性。
3．酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。
思考题
1．随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说 明反应速度逐渐降低，这是为什么？
2．如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中 进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系 中产物的生成量，并绘制酶促反应进程曲线，该 方法和本实验采用的方法结果会一致吗?哪个更好 一些？
❖ 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应 受多种因素干扰。
实验三 蛋白质含量的测定
目的
1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的
操作技术
原理
微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量
❖ 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应 生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分 解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准 酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中 氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。
❖ 4.离心：4℃,4000rpm/min， 离心10分钟。
❖ 5.保存：将离心管中大部分上 清液倒入量筒中，少部分接近 沉淀物的上清液经滤纸过滤， 一并收入量筒中以测量体积， 然后倒入三角烧瓶中，做好标 记，用塑料薄膜密闭，作为 “原酶液”
计算：
6、将原酶液精确三等分，一份进行梯度盐析提 纯；一份放于冰箱内保存，用来做凝胶过滤层析 （实验六）；一份用于酶固定化实验。
❖VIS-7200型可见分光光度计 ❖数显恒温水浴锅 ❖试管 ❖试管架
实验试剂
❖ 酸性磷酸酯酶酶液 ❖5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷
酸苯二钠(C6H6Na2PO4·2H2O，相对分子质量 254.10)2.54 g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配 成了100 mmol／L磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。 用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得 5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。
❖ 根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每 分钟生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个 活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷 法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
❖ 本实验所采用的是Folin-酚法。
实验材料及仪器
1.高速冷冻离心机： 2.电子天平或托盘天平 3.手术剪 4.100ml烧杯 5.100ml三角烧瓶 6.漏斗 7.纱布 8.滤纸 9.碾钵 10.培养皿 11.100ml量筒 12.一次性手套 13.记号笔 14.紫贻贝：
❖ 因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含 氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。
❖ 三聚氰胺（化学式：C3H6N6），俗称蜜胺、蛋白精，IUPAC命名 为「1,3,5-三氨基-2,4,6-三嗪」，是一种三嗪类含氮杂环有机 化合物，被用作化工原料。 它是白色单斜晶体，几乎无味，微 溶於水，可溶於甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等， 具毒性，不可用於食品加工或食品添加物。
7.梯度盐析
粗酶液
4000rpm/min 离心，10min
+35g/100ml硫酸铵 4℃，静置2h
沉淀
上清液
4000rpm/min +70g/100ml硫酸铵 离心，10min 4℃，静置2h
沉淀
合并
溶于缓冲液中
❖ 8、透析：将缓冲液中的粗酶液装入透析袋中 ，并对同样的缓冲液充分透析。
❖9、定容：将透析后的酶液定容，得透析后酶 液，用于后续实验。
❖0.2 mol／L的pH5.6乙酸盐缓冲液。 ❖Folin-酚试剂 ❖1 mol／L碳酸钠溶液。
实验步骤
具体时间控制表
结果
1、画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制 进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出 酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分持温和条件，反应液要避免剧烈搅 拌或震荡。
酶工程实验
Main contents
酸性磷酸酶的提取 酶促反应进程曲线的制作
蛋白质含量的测定 酸性磷酸酯酶的酶活力测定 酸性磷酸酯酶米氏常数的测定 凝胶过滤层析纯化酸性磷酸酶 酸性磷酸酯酶的检测—SDS-PAGE电泳法
酸性磷酸酯酶固定化 设计型实验
实验一 酸性磷酸酯酶的提取
实验目的
❖掌握胞内酶的分离提取方法。 ❖学会离心机的使用。