产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
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产淀粉酶芽孢杆菌的分离、 产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶 的分离 活力
杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法
注明： 注明：蓝色字体是已修改的 一、 பைடு நூலகம்验目的
1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、 实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量 在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中 产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利 用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的 菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢 杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的 枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上 菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉 呈蓝色，水解圈无色。
镜检确认为芽孢杆菌后，挑菌置斜面培养基（种子培养基）上进 行培养。将斜面培养基放入37℃培养箱中培养24小时。 7、发酵培养 从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株在无菌操作下转移到发 酵培养基上进行发酵。发酵的条件为37摄氏度，200r/min摇床培养过 夜,24h.。 7、酶活测定 将发酵液8000r/min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重 复3次，最后结果取平均值。 取5mL0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10分钟，然后 加适当稀释的酶液0.5mL，反应5分钟后，用5mL0.1mol/L三氯乙酸 终止反应。取0.5mL反应液与5mL碘液显色，在620nm处测光吸收值。 以0.5mL水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓 冲液）的管为对照。 五、酶活力计算 酶活力根据下式计算： 酶活力（u/mL）=（R-r）*50*D R 式中R、r分别表示对照和反应液的光吸收值，D为酶的稀释倍 数。调整D使（R-r）/R在0.2—0.7之间。 确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。
三、实验材料
1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米 左右 处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠 0.5%， 牛肉膏 0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉 0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml 发酵培养基：玉米粉 2% ， 黄豆饼粉1.5 %， CaCl2 0.02% ，
MgSO4 0.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬 酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液 100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管 （1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、 载玻片若干， 5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生 化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微 镜，接种环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混 悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白 胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中 培养两天 ，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到106，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂 布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培 养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出 现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大 的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放 入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选 菌落是否为芽孢杆菌。 6、纯培养
杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法
注明： 注明：蓝色字体是已修改的 一、 பைடு நூலகம்验目的
1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、 实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量 在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中 产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利 用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的 菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢 杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的 枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上 菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉 呈蓝色，水解圈无色。
镜检确认为芽孢杆菌后，挑菌置斜面培养基（种子培养基）上进 行培养。将斜面培养基放入37℃培养箱中培养24小时。 7、发酵培养 从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株在无菌操作下转移到发 酵培养基上进行发酵。发酵的条件为37摄氏度，200r/min摇床培养过 夜,24h.。 7、酶活测定 将发酵液8000r/min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重 复3次，最后结果取平均值。 取5mL0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10分钟，然后 加适当稀释的酶液0.5mL，反应5分钟后，用5mL0.1mol/L三氯乙酸 终止反应。取0.5mL反应液与5mL碘液显色，在620nm处测光吸收值。 以0.5mL水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓 冲液）的管为对照。 五、酶活力计算 酶活力根据下式计算： 酶活力（u/mL）=（R-r）*50*D R 式中R、r分别表示对照和反应液的光吸收值，D为酶的稀释倍 数。调整D使（R-r）/R在0.2—0.7之间。 确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。
三、实验材料
1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米 左右 处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠 0.5%， 牛肉膏 0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉 0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml 发酵培养基：玉米粉 2% ， 黄豆饼粉1.5 %， CaCl2 0.02% ，
MgSO4 0.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬 酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液 100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管 （1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、 载玻片若干， 5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生 化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微 镜，接种环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混 悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白 胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中 培养两天 ，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到106，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂 布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培 养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出 现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大 的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放 入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选 菌落是否为芽孢杆菌。 6、纯培养