Western基本步骤
Western实验步骤
转染（24-well）步骤1、贴壁细胞，0.5×105/500μl无抗生素培养基2、0.8μgDNA加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)3、2μl Lipofctoomine TM2000加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)，室温5min4、混合后室温20min共100μl5、每孔加100μl，混匀6、37℃培养18-48h，4-6h是更换培养基型号总体积DNA Lipo200096-well 100μl 0.2μg 0.5μl24-well 500μl 0.8μg 2μl6-well 2ml 4.0μg 10μl60-mm 5ml 8.0μg 20μl10-cm 15ml 24μg 60μlWestern Blot步骤一、蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取（Monolayer adherent cells）:1、倒掉营养液，用冰预冷的PBS洗三次，弃净PBS后把培养皿置于冰上（期间标记EP管，用冰）2、1ml三去污裂解也加7μl PMSF（苯甲基磺酸氟）、1μl aprotinin(抑肽酶)、1μl leupetin（亮氨酸）、1μl pepstain(胃酶抑素)摇匀置于冰上。
也可以用冰冷PBS转移至EP管离心后再裂解，可操作性更强。
用量：6孔板每孔25μl，60mm2平皿70μl。
用过的scraper先用75%乙醇洗，再用超纯水洗3、在冰上用塑料细胞刮刮下贴壁细胞，用加样器吸至EP管中，4℃冰箱中震荡15分钟4、于4℃下12000rpm离心30min（提前开离心机预冷）5、将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中放于-20℃保存（2）组织中总蛋白的提取1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
裂解完一管先用75%乙醇洗，再用超纯水洗，最后用吸水纸吸干。
western步骤
1、组织蛋白的提取取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。
几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。
裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。
2、蛋白含量的测定（1）制作标准曲线从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
取96孔板，按下表加入各种试剂。
混匀后，室温放置2min。
在酶标仪上比色分析，测量OD值。
表2，标准曲线的制备0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml（2）检测样品蛋白含量①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min，后即可用于测蛋白。
②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。
③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。
3、SDS-PAGE电泳（1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直置于架上准备灌胶。
（2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
western操作全过程
Western Blot一．配胶注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP（分离胶浓度越高AP浓度越低，）及TEMED 即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到一定浓度。
封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，将玻璃板倒立放置片刻控净。
灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)二．组织样品处理匀浆肝组织可每50mg加0.5ml裂解液，可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
12000g离心，4℃，2min。
取少量上清考马斯亮蓝进行定量。
将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。
三．电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
western 操作步骤
Western 操作步骤（三）SDS——PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边）2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。
3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。
弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。
4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。
5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。
电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul（3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。
电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜（四）转膜（1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。
将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。
western步骤
Western blotting 步骤一、配胶二、电泳三、转膜1、用甲醇润湿硝酸纤维素膜2、用1×transfer buffer浸泡滤纸，海绵，之后将夹板（黑色）朝下，将海绵放底部，两张滤纸，胶放在滤纸上，胶的上样孔朝下，刮走气泡，加上硝酸纤维素膜，加两层滤纸，加海绵，夹住。
3、放到转膜槽内，黑板对黑板，放入仪器带的那个小冰槽。
4、100V电压，100min，在外围加上冰，这个过程中电压会逐渐降低到80V。
四、剪膜，加一抗1、将1g 脱脂奶粉加到15ml的离心管中，加20ml 1×TBST (0.1%Tween) ，震荡混匀即为5%的milk。
2、时间到后将纤维膜取出，用丽春红染色一两分钟，水中洗一下，扫描图片后剪膜，剪去边缘多余的膜。
3、把膜放在一个小盖子中（枪头盒盖子就行），倒入配好的5%的牛奶，封闭30-40min。
4、把膜放在纸上吸一下水，放入自封袋中。
5、配一抗，GST抗体比例一般为（1:1000）即1微升抗体加到1ml TBST 中，混匀加到自封袋中，封袋子。
6、摇床上孵育两小时后可以放在4度冰箱里过夜，也可以继续下面的实验。
五、加二抗1、剪开袋子，取出膜，放入盖子中，加1×TBST，摇床上晃10min。
重复两次即洗三次。
2、加二抗，GST抗体的二抗为鼠单抗，取鼠抗2微升，加到10ml 1×TBST 中，混匀，倒入盖子中，摇床上晃1h。
3、加1×TBST洗三次，10min每次。
六、显色1、配显色液（现用现配）AP buffer 2ml /1mlBCIP 6.66微升/3.33微升NBT 13.33微升/6.66微升2、膜在水中洗一下，纸吸一下水，放到显色液中，显色大约几分钟或者时间更长。
3、扫描图片七、buffer配方1、10×running buffer2、10×transfer buffer30.3g Tris碱+144g 甘氨酸，定容到1L ddH2O中。
简述western印迹的基本过程
简述western印迹的基本过程Western印迹是一种常用的分子生物学技术，它可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术主要包括以下几个步骤：样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等。
一、样品制备Western印迹技术需要使用样品来进行分析，通常我们需要从细胞或组织中提取蛋白质。
提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，例如RIPA缓冲液法、SDS-PAGE法等。
提取后的蛋白质需要经过浓缩和纯化处理，以便于后续的电泳分离。
二、电泳分离将制备好的样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
根据蛋白质大小不同选择不同浓度的凝胶，通常使用10%或12%聚丙烯酰胺凝胶。
在电泳过程中，蛋白质会被拉伸成条状并向阳极移动。
三、转膜将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯膜上。
转膜的目的是将凝胶上分离出来的蛋白质迁移到一个新的固体载体上，以便于后续的探测。
通常使用半湿式或干式转膜法。
四、阻断在转膜后，需要对聚乙烯膜进行阻断处理，以避免非特异性结合和减少假阳性结果。
通常使用5%的非脂类奶粉或3%的BSA进行阻断处理。
五、一抗在阻断处理后，加入第一抗体进行特异性结合。
第一抗体可以是单克隆或多克隆抗体，具有高度特异性和亲和力。
将第一抗体加入后，在室温下或4℃下孵育数小时甚至过夜。
六、二抗探针探测加入与第一抗体来源不同物种的二抗（例如羊或马）与荧光素等探针进行反应，通过荧光素发射信号检测目标蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术中最常用的二抗是HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗。
七、成像和分析Western印迹技术的结果可以通过化学发光、荧光或放射性等多种方法进行检测。
Western印迹技术的结果通常以数字图像的形式保存下来，可以使用专业软件进行分析和定量。
综上所述，Western印迹技术是一种常用的分子生物学技术，通过样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等步骤，可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
western步骤
1、SDS-PAGE电泳将电泳仪的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上,加满蒸馏水试漏后，准备灌胶。
按说明书配制分离胶及浓缩胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶。
待胶面升到适宜高度后在胶上加水封胶，隔离空气使凝胶速度加快。
分离胶凝固后，吸去胶上层的水，将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。
待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两侧竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。
按5：1比例向样品加入溴酚蓝，并于沸水中煮5 min，计算100 µg蛋白的溶液体积即为上样量。
用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加样孔中。
恒压100 V，电泳至溴酚蓝刚跑到分离胶最下端即可。
2、转膜2.1 湿转在加有转膜液的瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝酸纤维素膜。
将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡。
在海绵垫上滤纸。
撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去。
根据marker显示，在所需分子量上下0.5 cm裁胶。
小心剥下胶条置于滤纸上并调整使其与滤纸对齐。
将NC膜盖于胶上，并在膜上盖张滤纸。
最后盖上另一张海绵垫，将夹子夹起。
整个操作在电转液中进行，并不断除去气泡。
将夹子放入电转槽中，并在夹子中加满电转液。
在电转槽中加入冰水，避免转移时大量产热。
恒流1A，电转80 min（电流及转膜时间根据分子量进行调整）。
2.2 半干转将滤纸及NC膜放入盛有半干转液的表面皿中，使NC膜充分浸透。
半干转仪上放滤纸，铺上NC膜，将胶置于膜上并赶气泡，最后盖上滤纸，将夹子夹起，装好仪器，调电流及转膜时间，转膜。
转膜电流=[NC膜（2×8cm）个数×0.04]A;转膜时间=（分子量+3）min（转膜时间根据转膜情况可上下调整）。
3 免疫反应将膜用washing buffer洗涤5 min后，移至含有封闭液的表面皿中，在脱色摇床上摇动封闭3 h。
从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗液面上。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
western原理及主要步骤
western原理及主要步骤Western原理及主要步骤Western原理是一种常用的蛋白质分析方法，通过电泳分离蛋白质并使用特定的抗体进行检测，从而可以定性和定量地分析目标蛋白质的表达水平。
本文将介绍Western原理的基本概念和主要步骤。
一、Western原理的基本概念Western原理是基于免疫学的方法，通过将蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺凝胶（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性抗体结合，再用次级抗体标记的酶或荧光物质进行检测。
通过观察标记物的产生或荧光信号的强度，可以得出目标蛋白质的表达水平。
二、Western的主要步骤1. 蛋白质样品的制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质样品。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆和切片等。
提取的样品需要添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
2. SDS-PAGE电泳分离：将蛋白质样品与含有SDS和还原剂的样品缓冲液混合，使蛋白质变性并带负电荷。
然后，将混合物注入到聚丙烯酰胺凝胶的孔中，通过电场作用使蛋白质在凝胶中分离。
较小的蛋白质会移动得更快，而较大的蛋白质则移动得更慢。
3. 蛋白质迁移：将分离的蛋白质从凝胶上转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。
这一步骤称为蛋白质的迁移或转印。
迁移可以使用湿式或半干式电泳转印系统进行。
4. 阻断和抗体结合：在蛋白质迁移膜上，需要进行阻断以防止非特异性结合。
常用的阻断剂有牛血清蛋白、非脂干奶粉和BSA等。
然后，将特异性抗体与目标蛋白质结合。
5. 检测和显色：使用次级抗体标记的酶或荧光物质，与结合了特异性抗体的蛋白质结合。
常用的次级抗体有HRP（辣根过氧化物酶）和AP（碱性磷酸酶）。
酶标法中，通过添加底物，可以使酶产生产生可见的颜色。
荧光法中，通过激发物质的激发光源，观察蛋白质所产生的荧光信号。
6. 图像分析：使用相应的成像系统记录酶标法的显色结果或荧光法的荧光信号。
western实验步骤
【实验步骤】1 试剂的配制1.1 30%丙烯酰胺（29:1）的配制（1）称取丙烯酰胺（Acrylamide）29g、甲叉双丙烯酰胺（Bisacrylamide）1g，置于100ml的烧杯中；（2）向烧杯中加入双蒸水约60ml，充分搅拌溶解，倒入量筒中；（3）加入双蒸水定容至100ml，用0.45μm滤膜滤去杂质；（4）置于棕色瓶中4℃保存，备用。
1.2 电泳缓冲液的配制（1）取Tris 3.0g、甘氨酸14.4g、10%SDS 10ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.3 电转缓冲液的配制（1）取Tris 3g、甘氨酸14.4g、甲醇200ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.4 TBST的配制（1）取1M Tris-Cl（PH7.4）20ml、氯化钠8.775g、吐温-20 0.5ml放入1L烧杯中，倒入双蒸水约600ml，充分搅拌溶解，然后倒入1L量筒中；（2）用适量双蒸水反复洗烧杯3次，并倒入量筒内；（3）加双蒸水定容至1L，混匀，置于玻璃瓶内常温保存，备用。
1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离胶（12%）的成分（15ml）双蒸水 4.9ml30%丙烯酰胺（29:1）6ml1.5M Tris-Cl（PH8.8） 3.8ml10%SDS 0.15ml10% AP 0.15mlTEMDE 6μl （2）浓缩胶的成分（5ml）双蒸水 3.4ml30%丙烯酰胺（29:1）0.83ml1.0M Tris-Cl（PH6.8）0.63ml10%SDS 0.05ml10% AP 0.05mlTEMDE 5μl1.6显影液的配制将小袋药粉先溶于约50℃适量温水中，完成溶解后再将大袋药粉加入至全溶，按照溶水量冷却至20℃使用。
WESTERN详细实验步骤
前期准备物品准备：平皿、眼科剪、小镊子、匀浆器、研磨器、枪头（10ul、100ul、1000ul）、EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（提蛋白的所有操作均在冰上）、超纯水、脱脂奶粉、热水/水浴缸。
配液准备：PBS液：PBS 1袋，2000ml超纯水。
（最好加热促溶，并提前消毒，4℃过夜备用）TBST液（洗膜液）：PBS液：Tween20=1000:1电泳缓冲液：Tris base 3.01g，甘氨酸 18.77g，SDS 1g，超纯水1000ml。
转膜液（1L）：Tris base 3.03g，甘氨酸 14.4g，超纯水 800ml，甲醇200ml。
封闭牛奶：脱脂牛奶 5g，TBST 100ml。
丽春红：考马斯亮蓝：化学发光底物（1ml）：A液、B液各0.5ml。
（B液需避光保存）SDS-PAGE 分离胶（一般选8%）：10%SDS用前先加热溶解；AP配成10%（1mlAP+10ml超纯水）分离浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20% H20 ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.930%丙烯酰胺2.673.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 101.5MTRIS-HCL(ph8.8)2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.810%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 AP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15TEMED 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul总体积（ML ）10ml 15mlSDS-PAGE 浓缩胶：操作步骤肝组织蛋白的提取准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP 管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作试剂浓度5%H20 ml 2 3 4 6 30%丙烯酰胺 0.5 0.75 1 1.5 1.5MTRIS-HCL(ph8.8)0.5 0.75 1 1.5 10%SDS 40 60 80 120 AP 30 45 60 90 TEMED 4ul 6ul 8ul 12ul 总体积（ML ）3ml4.5ml6ml9ml均在冰上）1、取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状；2、加入组织裂解液约500ul（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20～30min；3、吸取组织液到已高压灭菌的EP管中，4℃离心，12000rpm×15min；4、取出EP管放在冰盒内，仔细吸取上清，取2ul的上清用于蛋白浓度的测定；5、剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min；6、瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。
Western基本步骤
Western基本步骤Westen blot一、配胶（一）安装胶架（二）配胶1、分离胶：10%（10ML）O 4 mlDdH230%Acr 3.3mlTris-Hcl(8.8) 2.5ml10%SDS 0.1ml10%过硫酸铵AP 0.1mlTEMED O.OO4ML2、积层胶: 4mlO 2.7 mlDdH230%Acr 0.67mlTris-Hcl(6.8) 0.5ml10%SDS 0.04ml10%过硫酸铵AP 0.04mlTEMED O.OO4ML注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。
不宜多加，否则胶易变硬脆裂。
2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。
易挥发，使用后立即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。
3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。
（三）灌胶1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。
O，压平分离胶界面。
待胶凝后可见分割折线。
2、分离胶上灌满ddH2O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。
可用乙醇代替ddH2O，用滤纸吸干。
3、分离胶凝后，倒去顶部ddH24、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。
5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。
略倾斜插入梳子可避免出现气泡6、20-30分钟后胶凝。
二、电泳（一）准备1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。
先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。
2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。
（二）上样和电泳1、10vl枪点样。
（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl）2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。
3、maker 3-3.5 vl。
Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。
4、盖上电泳槽，接通电源。
积层胶电压80V，分离胶160V。
电流28mA。
western实验步骤
western实验步骤Western实验步骤西方实验法（Western blotting）是一种常用的蛋白质分析技术，可以用来检测目标蛋白在复杂混合物中的存在以及其相对丰度。
本文将介绍Western实验的步骤。
1. 样品制备需要从细胞或组织中提取蛋白质。
可以使用细胞裂解液或蛋白质提取缓冲液来裂解细胞，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
然后，使用离心等方法将细胞碎片与其他细胞组分分离。
最后，将得到的蛋白质溶液进行浓缩和纯化，以获得高质量的蛋白样品。
2. SDS-PAGE电泳将样品中的蛋白质按照其分子量大小通过SDS-PAGE电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品与Laemmli缓冲液混合，并在加热后进行电泳。
电泳时，将样品注入凝胶孔中，并在电场作用下进行分离。
蛋白质在凝胶中的移动速度受到其分子量的影响，较小的蛋白质迁移得更远。
电泳结束后，用染色剂染色来可视化蛋白带。
3. 转膜将电泳后的蛋白质从凝胶中转移到膜上，以便进行后续的免疫检测。
通常使用半干法或湿法转膜的方法。
在半干法中，将电泳片与膜和吸收纸堆叠在一起，用电流将蛋白质转移到膜上。
在湿法中，将电泳片和膜分别浸泡在缓冲液中，并通过电流进行转膜。
转膜完成后，可以通过Ponceau染色来验证转膜效果。
4. 阻断和抗体处理为了减少非特异性结合，需要在膜上进行阻断处理。
常用的阻断剂包括非脂类干乳或BSA。
将膜浸泡在阻断液中，以阻断未结合的蛋白质结合位点。
然后，将膜与目标蛋白特异性的一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验的目的和样品的特点来确定。
将膜与抗体孵育一段时间后，用缓冲液洗涤膜以去除未结合的一抗。
5. 二抗检测在处理完一抗后，需要使用与一抗来源物种不同的二抗来检测目标蛋白的存在。
二抗一般是与酶或荧光标记结合的抗体。
将膜与二抗进行孵育，并再次用缓冲液洗涤膜以去除未结合的二抗。
然后，使用适当的检测方法来可视化目标蛋白。
6. 结果分析根据实验目的和所用的检测方法，可以使用化学发光、荧光成像或酶标记等技术来检测和量化目标蛋白的存在。
Western印迹法原理、操作步骤及应用
Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。
三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。
细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。
然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。
（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。
SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。
它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。
SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
Western(试剂配制和操作步骤)
Western（试剂配制和操作步骤）试剂配制：（一）母液（二）使用液操作步骤：（一）蛋白样品制备（二）蛋白含量的测定（三） SDS －PAGE电泳（四）转膜（五）免疫反应（六）化学发光，显影，定影（七）凝胶图象分析这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris•HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml10％SDSSDS 10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
20％Tween20Tween20 20ml蒸馏水至100ml混匀后4℃保存。
（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100?g/ml PMSF）：1mol/L Tris•HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后，4℃保存。
Western实验步骤
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
western试验步骤及注意事项
western试验步骤及注意事项W estern实验步骤1．制胶及上样：（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm 的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。
待胶完全聚合。
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5?样品缓冲液，以1?样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
2．电泳（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。
（约30分钟）（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。
（约60分钟）3．转膜（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
4．染色（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。
5．封闭把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。
6．洗膜与杂交（1）以T-TBS洗膜，10分钟? 3次。
（2）第一抗体封闭：SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
western蛋白提取步骤
western蛋白提取步骤•相关推荐western蛋白提取步骤蛋白提取方法一、对于培养细胞样品：1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入100-200微升（6cm培养皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2 秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
3. 在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。
二、对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的`最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
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Westen blot一、配胶（一）安装胶架（二）配胶1、分离胶：10%（10ML）O 4 mlDdH230%Acr 3.3mlTris-Hcl(8.8) 2.5ml10%SDS 0.1ml10%过硫酸铵AP 0.1mlTEMED O.OO4ML2、积层胶: 4mlO 2.7 mlDdH230%Acr 0.67mlTris-Hcl(6.8) 0.5ml10%SDS 0.04ml10%过硫酸铵AP 0.04mlTEMED O.OO4ML注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。
不宜多加，否则胶易变硬脆裂。
2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。
易挥发，使用后立即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。
3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。
（三）灌胶1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。
O，压平分离胶界面。
待胶凝后可见分割折线。
2、分离胶上灌满ddH2O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。
可用乙醇代替ddH2O，用滤纸吸干。
3、分离胶凝后，倒去顶部ddH24、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。
5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。
略倾斜插入梳子可避免出现气泡6、20-30分钟后胶凝。
二、电泳（一）准备1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。
先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。
2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。
（二）上样和电泳1、10vl枪点样。
（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl）2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。
3、maker 3-3.5 vl。
Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。
4、盖上电泳槽，接通电源。
积层胶电压80V，分离胶160V。
电流28mA。
（恒压80V待Maker变红，转为160V，待成为一条直线）注意事项：1、枪头顶着泳道正上方加样。
2、电泳时温度上升，用冰袋围绕电泳仪使降温。
3、跑分离胶电压在130-160V之间，低于130V时时间较长，高于150V时较快但温度高电压大易烧坏胶。
4、细胞蛋白上样10vl左右，组织蛋白上样20vl左右。
5、当需要上样量较大或超过孔位最大上样量时，可先加一部分样跑电泳，然后再加剩下样本，使全部分样本在积层胶内汇集。
三、转膜（湿法）1、电泳结束后，撬开短玻璃板，切去积层胶，浸泡于转膜液。
2、用直尺或梳子量出凝胶大小，按尺寸剪滤纸和硝酸纤维素滤膜（PVDF膜）。
3、PVDF膜先浸入泡膜液（甲醇）中活化，然后放入转膜液中清洗。
4、海绵，滤纸，膜湿润，阴极电极（黑面）在下，从下到上顺序为：海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵。
膜与胶精准对齐，盖好滤纸后用玻璃棒赶出气泡。
5、转膜一般为80Ma,2小时。
当目标蛋白为72bp以上时转3h，72bp以下时转1.5-2h。
（210V，200MA，时间根据蛋白分子量来定）注意事项：1、撬胶时尽量把胶留在厚板上，记录上样顺序。
2、滤纸为3层，可重复利用，但最好使用1-2次后更换。
四、染胶考马斯亮蓝染料浸染，摇床5h。
使用脱色液脱去多余染料，可见胶中有蛋白的部位出现蓝色条带，证明胶中相应条带有目的蛋白。
在转膜前染胶可验证所提蛋白中是否有目的蛋白；在转膜后染胶验证转膜知否彻底。
五、染膜丽春红染料染膜，可见膜上有蛋白的部分出现红色条带，沿条带剪膜可避免漏剪或剪歪。
用dd水即可洗净染料。
六、封闭把膜放入装有封闭液的塑封袋中，一张膜1ml左右。
30°摇床1h。
O加入0.3g。
封闭液为3%BSA（牛血清蛋白），10mlddH2注意事项：1、首次做蛋白时可不做封闭，此时膜显色后背景较深。
看情况需要背景较浅时可做封闭。
2、封闭液4℃保存七、结合一抗1、蛋白一抗：稀释液为含有1%BSA的TBST（稀释的比例按说明说来进行条件摸索）2、将膜放入相应的塑封袋中，拍出气泡，4℃摇床过夜（12h）或常温2h摇床。
3、一张膜1.5ml左右，2张膜2-3ml，2张一起时膜的背面相贴。
注意事项：1、一抗放4℃保存半个月，可重复利用多次。
应一抗价格昂贵一般使用3-4次。
2、稀释抗体使用含有1%BSA的TBST溶液。
八、结合二抗1、取出一抗回收，膜使用1*TBST清洗，摇床，7min一次，洗三次。
（LST 15min*2+5min*4 荧光二抗 10mlBSA:1ul二抗 1小时）2、将滤膜放入有二抗的塑封袋中，去除气泡，37℃孵育30-40min。
最好是30℃孵育1h。
二抗稀释比 1:7500，配10ml。
或7.5mlTBS-T（含1%BSA）水中加入10µl二抗，3.5ml中加0.5µl二抗。
注意事项：二抗放4℃保存半个月，可重复利用，二抗无特异性较便宜一般使用3-4次。
九、染色1、取出二抗回收，膜使用1*TBS-T清洗，摇床，5min一次，洗三次。
LST 15min*2+5min*42.荧光显影液 A：B=12、将膜放入干净平皿中，注入1~2ml底物染色液，使用1ml枪将液体反复注于膜表面，5-10分钟后可见蛋白条带显蓝色。
3、用三蒸水清洗停止显色反应。
十、拍照留存试剂配方一、10*电泳液Tris-base 15.2g甘氨酸 94gSDS 5gDdH2O 500ml配好后需放置一段时间才可溶解。
1*电泳液 10*电泳液 100mlDdH2O 900ml注：不用再加SDS，如果10*电泳液中没加SDS则此时添加10%SDS10ml，890ml DdH2O.在配置的时候要定容，所以先加一些水，而且，电泳液好起泡泡，会有损失并且实体积胀大，所以配置的时候要轻柔加勺搅拌二、10*转膜液Tris-base 15.1g甘氨酸 72gDdH2O 500ml配好后需放置一段时间才可溶解。
1*转膜液10*转膜液 100ml甲醇 200mlDdH2O 700ml三、10*TBS Tris-base 12.114gNacl 43.9g浓Hcl 5mLDdH2O 500ml室温贮存。
1*TBST 500ml 1*TBS +500ul吐温第一抗体第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。
种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
第二抗体第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。
用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体。
区别第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。
第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。
主要用于检测抗体的存在。
一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。
即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。
也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。
一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）。
一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。
一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。
二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。
如果一抗自己带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。
但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物。
所以如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。
而一抗识别底物。
这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
A MPK（Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase）即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。
它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。
遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。
由于分子机制十分复杂，药物分子激活AMP是一个巨大的挑战，但其激活能改善由II型糖尿病引起的代谢失衡。
AMP蛋白激酶（AMPK），它主要控制细胞新陈代谢：它会决定身体中的脂肪是储存还是燃烧，这主要取决于细胞中总能量。
当细胞能量水平较高时，细胞中存在高浓度的能量分子ATP（三磷酸腺苷），因此AMPK会促使细胞进行“合成代谢”，将多余能量作为脂肪储存下来；当ATP水平较低时，AMPK将关闭合成代谢，反而激发分解代谢，让脂肪燃烧为能量。
研究人员表示，AMPK能作为治疗2型糖尿病的一种有效手段。
当AMPK探测到细胞中ATP浓度较低时，它们会利用各种机制使细胞中的葡萄糖变为ATP。
对于啮齿类动物的实验已经表明，AMPK对于降低血糖是有效的。
PPAR分子含α、β、γ三型，分布在各不同组织，它的功能涵盖的范围之广是现今已知的其他生物医药分子所难望其项背，包括糖尿病、肥胖、高血压等代谢症候群，免疫发炎疾病如类风湿性关节炎，皮肤及伤口愈合，以及最近发现的多种癌症的治疗，PPAR分子都参与其中，并且扮演非常重要及突破性的角色。
而这些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问题。
引藻是有大量PPAR的，引藻的调脂降糖作用与其含有PPAR配体成分而激活人体内的PPAR有关。
PPAR有三种亚型，即PPARA、PPARA/A、PPARA，它们在脂肪细胞分化、脂质代谢、糖代谢、胰岛素敏感性等病理生理过程中起到重要作用。
目前已有多种PPAR配体被开发成药物，例如贝特类（PPARA配体）及噻唑烷二酮类（PPARA配体）分别能有效地治疗血脂异常及2型糖尿病。
引藻含有的PPAR配体可以激活人体内PPAR分子，有效清除因病毒感染导致胰岛受损所引起的胰岛抵抗。
达到平稳降糖，从根本上消除糖尿病病因。
并逐渐改酸性体质为碱性体质，因此对糖尿病患者相当有帮助。
此外，引藻中含有次麻油酸，对于稳定血脂质浓度的功效早已被确认。
另外，引藻还可以预防糖尿病病人最严重的动脉硬化所引起的心脏、肾脏、及脑溢血等并发症。
固醇调节元件结合蛋白1（Sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1）是重要的核转录因子之一,能调控内源性胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需酶的表达,以维持血脂动态平衡。
研究表明,SREBP-1及其靶基因网络的异常可引起胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病、心功能紊乱、血管并发症和肝脂肪变等一系列代谢性疾病。
近年高通量组学技术的发展极大扩展了对SREBP-1靶基因及其转录调控模式的了解。