华中农业大学病毒学实验技术 第六章 病毒纯化 (2013)
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]
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病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。
操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。
每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。
呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。
在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。
许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。
实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。
与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。
采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。
同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。
许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。
尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。
此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。
如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。
将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。
如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。
将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。
如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。
经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。
病毒的提纯
病毒的提纯(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖，要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。
有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒，病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA 病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。
实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。
通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2 000～6 000r/min 离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。
(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。
(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。
当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。
(一)沉淀法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1.中性盐沉淀法病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。
在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6 000的PEG。
将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。
Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
病毒纯化与分析
01
02
03
病毒的致病机制
研究病毒如何与宿主细胞 相互作用，导致疾病的发 生和发展，有助于深入了 解病毒的致病性。
病毒的宿主范围
研究病毒在不同宿主细胞 中的复制和传播能力，有 助于确定病毒的宿主范围 和传播途径。
病毒变异
研究病毒的基因组变异和 进化，有助于了解病毒的 变异规律和演化趋势，为 预防和治疗提供依据。
病毒的疫苗研究
疫苗靶点筛选
通过分析病毒的抗原结构和免疫原性，确定疫苗的靶点，为疫苗 设计和研发提供依据。
疫苗免疫效果评估
通过分析免疫后机体的免疫应答和保护效果，评估疫苗的有效性 和安全性。
疫苗生产工艺优化
通过对疫苗生产工艺的研究和改进，提高疫苗的生产效率和产品 质量。
病毒的抗病毒药物研究
药物靶点筛选
高通量分析
高通量测序和质谱技术的结合将使病毒基因组和蛋白质组的分析更加快 速和准确，有助于更全面地了解病毒的变异和进化。
03
临床应用拓展
随着病毒纯化与分析技术的不断完善，其在临床诊断、治疗和药物研发
中的应用将更加广泛，有助于提高病毒性疾病的诊断准确率Biblioteka 治疗效果。对抗病毒的挑战与机遇
挑战
病毒变异和进化速度快，导致病毒的检测和防治难度增加；同时，病毒性疾病 的诊断和治疗仍存在许多难点，如缺乏特效药物和疫苗。
通过分析病毒的生命周期和复制过程，确定药物的靶点，为药物设 计和研发提供依据。
药物效果评估
通过分析药物对病毒复制和感染的影响，评估药物的有效性和安全 性。
药物生产工艺优化
通过对药物生产工艺的研究和改进，提高药物的生产效率和产品质量。
05 结论
病毒纯化与分析的未来发展方向
华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化(XXXX).pptx
利用各种物理、化学方法，以不使 病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细 胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓 缩的病毒样品。
✓病毒微细结构的研究 ✓病毒抗原蛋白的分离纯化 ✓病毒化学成分及其遗传物质的研究 ✓病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
➢ 保持感染性 ➢ 具有均一性：大小、形态、密度、化学组成、
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特
点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适 宜的纯化方法。 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后 收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材 料。
2．病毒提纯浓缩 ✓去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病 毒，在大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径 大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入 1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。
离心30min，收集上清液。 ✓硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭 菌ddH2O悬浮。 ✓透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或 PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次， 第5次透析过夜。
（二）层析法
✓葡聚糖柱层析法 ✓凝胶层析法 ✓离子交换柱层析法 ✓亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同 而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
5.病毒的培养与纯化
四、病毒的培养和纯化
同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于
研究方法和技术手段的发展。
通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物
是病毒学研究和实践的基本技术。
1、病毒的培养
病毒的培养：二元培养物法
1、病毒的培养
培养液
细菌培养液变清亮
噬菌体细菌培养物
营养琼脂平板
细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，
经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局
部透明区域，即噬斑（plaque）。
如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对
噬菌体的数目进行估算。
1、病毒的培养
动物病毒实验动物
鸡胚
多种细胞培养
1、病毒的培养
大多数动物病毒感染敏感细胞
培养能引起其显微表现的改变
，即产生致细胞病变效应
（cytopathic effect,CPE），例如
细胞聚集成团、肿大、圆缩、
脱落，细胞融合形成多核细胞，
细胞内出现包涵体（inclusion
body），乃至细胞裂解等。
1、病毒的培养
若标本经过适当稀释进行接
种并辅以染色处理，病毒可
在培养的细胞单层上形成肉
眼可见的局部病损区域，即
蚀斑（plaque）或称空斑。
1、病毒的培养
植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑
四、病毒的培养和纯化
2、病毒纯化
病毒是有感染性的生物体
标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒具有化学大分子的属性
纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性。
病毒学实验技术
病毒学实验技术实验一鸡胚接种器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）一．精卵的选择、孵育和检卵1.受精卵的选择1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响2）最好是白克蛋3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
2.孵育1）孵箱温度保持37.5—38.5℃2）相对湿度：50-60%3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次3.检卵孵育后第4天开始，每天检卵一次。
4日卵可见血管。
未受精卵不见血管鸡胚。
死胚血管模糊，无胎动。
二．鸡胚的结构1．卵壳上有细孔，以行气体交换2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流3．气室呼吸和调节压力—卵壳孔交换4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O25．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。
6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水7．卵黄早期养分8．卵白晚期养分三．接种前处理1．做接种记号2．消毒四．接种途径卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下2）碘及酒精消毒气室端3）钢锥在气室中央锥一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚方法二：1）2）同一3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚5）封孔，续孵，弃24h内死胚2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒2）在气室端开一1.5×1.5口3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜4）滴入接种物5）胶布或透明纸封口方法二：（人工气室）1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗3）在气室端中央钻一个小孔4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒2）钢锥锥一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途二．实验步骤：1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次4.剪碎近于乳糜状5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。
病毒的纯化与保存课件
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分子量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性。
当蛋白质的分子量在 15,000 － 200,000 之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－ b m
• Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不 同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴 大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极 限越大，分离范围也越大。 G-25 分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其 它小分子的分离； G-200 分离范围 5000-600000 适用于蛋白分离纯 化、分子量测定、平衡常数测定。
Western Blot 蛋白质鉴定
• 原理(重点掌握)：将SDS-PAGE上的蛋白质 转移到硝酸纤维素膜上，让第一抗体与 膜上的目的蛋白质的抗原决定簇结合， 然后用经过特定酶标记的第二抗体结合 第一抗体，加入酶的显色底物即可检测 的目的蛋白条带熟悉)
• 1、SDS-PAGE电泳结束后，不染色，进行转膜 ，把SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到NC膜或PVDF 膜上。(注意凝胶和膜的放置方向)
凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶
• 是由0.1 mol/L焦磷酸钠和0.1 mol/L MgCl2，以2 ：10(体积)比例在室温中缓慢滴加混合而获得 的较稳定的焦磷酸镁凝胶。 • 将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于 凝胶，然后用0.1 mol/L盐水洗2次，最后用0.3 mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回 收于水相中。
浓缩胶
分离胶
首次应用SDS-PAGE的论文(了解)
• Laemmli UK (1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
病原分子生物学实验技术-2013
酶切位点添加
载体自连？
PRRSV ORF7酶切位点
插入方向？ 同尾酶？
读码框校正（BamH I+Hind III）
30a（+）
5‘-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGAAAGCTT -3’
Gly-Ser-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA)
PCR电泳检测结果
M1 1 2 3 4 5 6 7 M2
15000bp 2000bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 250bp
对照
ORF7 PCR产物
胶回收法回收PCR产物
1、将PCR扩增产物，在0.8%琼脂糖回收胶中上样电泳。 2、在长波紫外灯下，用刀片切下目的片段，装入1.5ml离心管中 ，按回收试剂盒说明书进行回收，最后用20μl ddH2O洗脱， 获得目的片段
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
Arg-Arg-His-(移码的PRRSV ORF7)
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
病毒的纯化和检测.ppt
(二) 病毒的数量与感染性测定
• 1.蚀斑测定
• 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。 病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养 琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中 可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如 中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而 破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑 (plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗 粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性 病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
• 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方 法；
• 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。
四、病毒萃取液的分级纯化
• 沉淀法 ➢中性盐沉淀法
➢聚乙二醇沉淀法
➢有机溶剂沉淀法 ➢等电点沉淀法
• 离心法
➢差速离心法 ➢密度梯度离心法
速率区带离心法 等密度区带法
➢凝胶色谱法 ➢电泳法
生产较复杂、成本高
生产简单、成本低
二、人工被动免疫
• 人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白， 或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不 同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋 白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲 型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者 不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用 含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig) 预防乙型 肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰 期短，故应注意有效期。
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乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物
原理：A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗
粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度
降低。
B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。
优点：分辨力高，易除去 缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质
4、等电点沉淀法（分辨力不高）
原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与 负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发 生沉淀（分辨力不高）。
淀，用透析法或其它方法脱盐。
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中
沉淀，且保持感染性。
2、聚乙二醇（PEG）沉淀法 用于病毒沉淀的分子量：2000-6000
将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG 加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4℃搅拌 过夜，然后离心使病毒沉淀。
3、有机溶剂沉淀法
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒
皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病
毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。
6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携
1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，
纯化的病毒是不是只含有病毒的蛋白？
病毒纯化 靶蛋白验证 质谱分析
PRV如何侵入细胞
免疫金标记
确定病毒的细胞 受体 解析病毒侵入细 胞的分子细节
是当前病毒感染 研究的重点
利用量子点(quantum dots)标记研究病毒的侵入
Internalization of IHNV particles through clathrin-mediated endocytosis
（四）吸附法
原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固
体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶
液把它们洗脱下来。
作为吸附剂必须具备的特点： 有较大的表面积和吸附能力 较高的吸附选择性 便于洗脱 性质稳定
常用吸附剂：
白土
磷酸钙
硅藻土
红细胞
离子交换树脂
羧甲基纤维素
（五）电泳法
离心时间 较短，几小时到几十小时 较长，十几小时到数天
A
A. 速度梯度离心
B. 密度梯度离心
B
… … … …
五、病毒纯化应注意的问题
1、保持病毒的感染性 严格控制温度、pH及试剂的选择。 2、选用适宜的纯化实验起始材料
无其它病毒或毒株的污染
病毒体的含量高
杂质含量少并易于处理
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的
硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫 酸 铵 ， 搅 匀 后 臵 4℃ 冰 箱 搅 拌 沉 淀 过 夜 ， 4℃
5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭菌
ddH2O悬浮。
透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或PBS
中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5 次透析过夜。
密度梯度离心
在离心管中加入不同浓度的CsCl或蔗糖垫层，再
加入病毒悬液，超高速离心。
蔗糖密度梯度离心：在离心管中加入20%～60%不连续蔗 糖密度梯度, 20000-25000r/min离心2h～3h ，收集蔗糖 浓度为35%处的病毒带，加入适量缓冲液稀释后，再次 20000-25000r/min离心2h，沉淀用适量TEN重悬。
层析法
两相溶剂间分配系数法
吸附法
电泳法
（一）沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。
中性盐沉淀法（盐析）
聚乙二醇沉淀法
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法 皂土法 鱼精蛋白沉淀法
1、中性盐沉淀法（盐析）
先用其它方法去除材料中的大量杂质，再
以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓
冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉
而鱼精蛋白仍然沉淀。
（二）层析法
葡聚糖柱层析法
凝胶层析法
离子交换柱层析法
亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法
原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同
而选择性地分配于其中的一方。
常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
聚乙二醇（PEG）
甲基纤维素（MC）
聚乙烯醇（PVA） 分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系
病毒体具有一定大小、形状和密度，可利
用超速离心技术提纯病毒
三、病毒纯化前的预处理
1、病毒感染的组织、脏器或细胞
研磨匀浆
超声波处理
反复冻融
低速离心去掉细胞碎片 2、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有的杂质或直接用 于病毒的分离纯化
四、病毒纯化的方法
沉淀法
超速离心法
超滤法
PrV鄂A株电镜观察
左图：上带中的PrV粒子 右图：下带中的PrV粒子
浓缩（方法二）
将经低速离心去掉细胞碎片及杂质的病毒悬
液直接20000-25000r/min离心2h。
弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬。 将重悬的病毒液再经梯度离心纯化。
如何利用纯化的病毒进行下一步的研究
研究病毒的结构 研究病毒感染的分子细节 病毒粒子的标记 研究与受体的结合 研究病毒的侵入 研究病毒在体内的移行
浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病 毒浓缩至合适的体积。 超离纯化： 速度区带离心
在离心管中加入不同浓度的甘油垫层，即先加入
45%甘油，再加入5%甘油。
加入病毒悬液（应不超过离心管总容积的10%）。 20000-25000r/min离心2h。 弃上层液体，沉淀用适量TEN重悬（涡旋或超声波 处理，使沉淀分散）。
2. 速度梯度离心法与密度梯度离心法
速度梯度离心法
原理
密度梯度离心法
沉降与颗粒质量成正比， 沉降与颗粒密度成正比， 以物质沉降速度的不同进 以物质浮密度的不同进行 行分离 分离 密 度 小 ， 1-1.3286， 预 制 密 度 大 ， 1-1.9025 ， 连 续 梯度，不连续 梯度
介质
稍强，速度相对低，使 强，离心速度高，使被分 离心力场 CsCl形成梯度，建立沉降 离物质易沉降 扩散平衡 离心过程 样品向离心管底沉降 样品停留于介质的等密度 部位
原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。
用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞 吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。 优点：可快速处理大量样品 步骤：低速（2000-3000r/min, 20-30min)、中速 （10000min, 20-30min)去除较大的宿主细胞碎片、 污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度 离心1-2h使病毒沉淀。
结晶形成 检测病毒制备物均一性的方法： 电镜观察：大小、形态均一
超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带
电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带
免疫学方法：只与特异性抗体发生反应
二、病毒纯化的理论依据
病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质， 可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒
特点、研究的目的以及实验室的条件等，选择
适宜的纯化方法。
4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯
1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变 后收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品 材料。
2．病毒提纯浓缩 去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min离
心30min，收集上清液。
（六）超滤法
利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小
的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。 优点： 可用于大容量样品的浓缩
可以在室温或低温下操作
对被浓缩产物的损害小 浓缩的同时可达到部分纯化 回收率高 可防止外来污染
（七）离心法 差速离心 速度区带离心法 密度梯度离心
1.差速离心法
第六章
病毒的纯化
利用各种物理、化学方法，以不使
病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细
胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓
缩的病毒样品。
病毒微细结构的研究
病毒抗原蛋白的分离纯化
病毒化学成分及其遗传物质的研究 病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
保持感染性
大小、形态、密度、化学组成、 具有均一性： 分子量、抗原性