华中农业大学病毒学实验技术 第六章 病毒纯化 (2013)
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(四)吸附法
原理:利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固
体吸附剂吸附病毒或吸附杂质,再用一定的盐溶
液把它们洗脱下来。
作为吸附剂必须具备的特点: 有较大的表面积和吸附能力 较高的吸附选择性 便于洗脱 性质稳定
常用吸附剂:
白土
磷酸钙
硅藻土
红细胞
离子交换树脂
羧甲基纤维素
(五)电泳法
原理:不同大小和比重的粒子沉降速度不同。
用途:从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞 吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。 优点:可快速处理大量样品 步骤:低速(2000-3000r/min, 20-30min)、中速 (10000min, 20-30min)去除较大的宿主细胞碎片、 污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度 离心1-2h使病毒沉淀。
纯化的病毒是不是只含有病毒的蛋白?ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
病毒纯化 靶蛋白验证 质谱分析
PRV如何侵入细胞
免疫金标记
确定病毒的细胞 受体 解析病毒侵入细 胞的分子细节
是当前病毒感染 研究的重点
利用量子点(quantum dots)标记研究病毒的侵入
Internalization of IHNV particles through clathrin-mediated endocytosis
病毒体具有一定大小、形状和密度,可利
用超速离心技术提纯病毒
三、病毒纯化前的预处理
1、病毒感染的组织、脏器或细胞
研磨匀浆
超声波处理
反复冻融
低速离心去掉细胞碎片 2、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有的杂质或直接用 于病毒的分离纯化
四、病毒纯化的方法
沉淀法
超速离心法
超滤法
而鱼精蛋白仍然沉淀。
(二)层析法
葡聚糖柱层析法
凝胶层析法
离子交换柱层析法
亲和层析法
(三)两相溶剂间分配系数法
原理:溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同
而选择性地分配于其中的一方。
常用的溶剂:葡聚糖硫酸盐(dextran sulphate, Ds)
聚乙二醇(PEG)
甲基纤维素(MC)
聚乙烯醇(PVA) 分配体系:Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系
PrV鄂A株电镜观察
左图:上带中的PrV粒子 右图:下带中的PrV粒子
浓缩(方法二)
将经低速离心去掉细胞碎片及杂质的病毒悬
液直接20000-25000r/min离心2h。
弃上层液体,沉淀用适量TEN重悬。 将重悬的病毒液再经梯度离心纯化。
如何利用纯化的病毒进行下一步的研究
研究病毒的结构 研究病毒感染的分子细节 病毒粒子的标记 研究与受体的结合 研究病毒的侵入 研究病毒在体内的移行
特点、研究的目的以及实验室的条件等,选择
适宜的纯化方法。
4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯
1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞,病变 后收集细胞培养物,反复冻融3次,即为样品 材料。
2.病毒提纯浓缩 去细胞碎片及杂质:将细胞培养物4℃ 3000r/min离
心30min,收集上清液。
离心时间 较短,几小时到几十小时 较长,十几小时到数天
A
A. 速度梯度离心
B. 密度梯度离心
B
… … … …
五、病毒纯化应注意的问题
1、保持病毒的感染性 严格控制温度、pH及试剂的选择。 2、选用适宜的纯化实验起始材料
无其它病毒或毒株的污染
病毒体的含量高
杂质含量少并易于处理
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的
结晶形成 检测病毒制备物均一性的方法: 电镜观察:大小、形态均一
超速离心:沉降速率和密度一致,只出现一条沉降带
电泳:颗粒大小及表面电荷均一,只形成一条电泳带
免疫学方法:只与特异性抗体发生反应
二、病毒纯化的理论依据
病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质, 可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒
淀,用透析法或其它方法脱盐。
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中
沉淀,且保持感染性。
2、聚乙二醇(PEG)沉淀法 用于病毒沉淀的分子量:2000-6000
将PEG配成50%左右的溶液,或直接将固体PEG 加于病毒悬液中,使其达到所需浓度,在4℃搅拌 过夜,然后离心使病毒沉淀。
3、有机溶剂沉淀法
密度梯度离心
在离心管中加入不同浓度的CsCl或蔗糖垫层,再
加入病毒悬液,超高速离心。
蔗糖密度梯度离心:在离心管中加入20%~60%不连续蔗 糖密度梯度, 20000-25000r/min离心2h~3h ,收集蔗糖 浓度为35%处的病毒带,加入适量缓冲液稀释后,再次 20000-25000r/min离心2h,沉淀用适量TEN重悬。
硫酸铵沉淀:按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫 酸 铵 , 搅 匀 后 臵 4℃ 冰 箱 搅 拌 沉 淀 过 夜 , 4℃
5000r/min离心40min,去上清,沉淀用适量的灭菌
ddH2O悬浮。
透析:将悬浮的病毒液装于透析袋中,于ddH2O或PBS
中搅拌透析,每半个小时换一次液,共换5次,第5 次透析过夜。
第六章
病毒的纯化
利用各种物理、化学方法,以不使
病毒受损伤和失活为前提,去除宿主细
胞组分等非病毒杂质,提取出高纯度浓
缩的病毒样品。
病毒微细结构的研究
病毒抗原蛋白的分离纯化
病毒化学成分及其遗传物质的研究 病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
保持感染性
大小、形态、密度、化学组成、 具有均一性: 分子量、抗原性
浓缩:透析完成后,取出,用聚乙二醇或蔗糖将病 毒浓缩至合适的体积。 超离纯化: 速度区带离心
在离心管中加入不同浓度的甘油垫层,即先加入
45%甘油,再加入5%甘油。
加入病毒悬液(应不超过离心管总容积的10%)。 20000-25000r/min离心2h。 弃上层液体,沉淀用适量TEN重悬(涡旋或超声波 处理,使沉淀分散)。
乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物
原理:A、降低溶液的介电常数,从而增加病毒颗
粒表面不同电荷之间的引力,导致其溶解度
降低。
B、与水作用,破坏蛋白质分子的水化膜。
优点:分辨力高,易除去 缺点:易使表面蛋白质变性,溶解脂质
4、等电点沉淀法(分辨力不高)
原理:病毒粒子在等电点时,所携带的正电荷与 负电荷相互中和,因而失去相互排斥的作用而发 生沉淀(分辨力不高)。
层析法
两相溶剂间分配系数法
吸附法
电泳法
(一)沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。
中性盐沉淀法(盐析)
聚乙二醇沉淀法
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法 皂土法 鱼精蛋白沉淀法
1、中性盐沉淀法(盐析)
先用其它方法去除材料中的大量杂质,再
以高浓度的中性盐溶液盐析,析出的沉淀用缓
冲液悬浮后再进行盐析,反复几次后,悬浮沉
2. 速度梯度离心法与密度梯度离心法
速度梯度离心法
原理
密度梯度离心法
沉降与颗粒质量成正比, 沉降与颗粒密度成正比, 以物质沉降速度的不同进 以物质浮密度的不同进行 行分离 分离 密 度 小 , 1-1.3286, 预 制 密 度 大 , 1-1.9025 , 连 续 梯度,不连续 梯度
介质
稍强,速度相对低,使 强,离心速度高,使被分 离心力场 CsCl形成梯度,建立沉降 离物质易沉降 扩散平衡 离心过程 样品向离心管底沉降 样品停留于介质的等密度 部位
(六)超滤法
利用超滤膜将水、盐及小分子滤过,将一定大小
的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。 优点: 可用于大容量样品的浓缩
可以在室温或低温下操作
对被浓缩产物的损害小 浓缩的同时可达到部分纯化 回收率高 可防止外来污染
(七)离心法 差速离心 速度区带离心法 密度梯度离心
1.差速离心法
多数病毒的等电点在pH4.0~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒
皂土在酸性条件下(pH4~4.5)可吸附轮状病
毒,在碱性条件下(pH8.5),又使其洗脱下来。
6、鱼精蛋白沉淀法(沉淀直径大于50nm的病毒)
鱼精蛋白为碱性蛋白,具有携带其它蛋白质(直
径大于50nm )共沉淀的作用,当向这种沉淀物加入
1mol/L NaCl时,其它蛋白质又重新释放到悬液中,