pET 表达系统

pET 原核表达pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。

Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。

根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。

没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。

在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。

未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。

而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。

pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。

pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。

有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。

使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。

B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。

BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。

两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。

Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。

Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。

新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。

其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。

这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

由于存在F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。

此外，Novagen 提供了λDE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

表达高毒性基因或制备新的λDE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA 聚合酶。

虽然不如用IPTG 诱导λDE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性T7 lac 启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET 系统中T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7 启动子和T7 lac 启动子。

T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。

该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在λDE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI 的机制（除了抑制lacUV5 ）。

含T7 lac 启动子的pET 质粒还具有它们自己的lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/ 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。

通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。

除了根据载体/ 宿主菌组合控制T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET 系统还根据诱导物（IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。

Tuner 和OrigamiB 宿主菌的lacY 突变使这种控制成为可能。

选择pET 载体所有的pET 载体均来自pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。

有两大类pET 质粒，即转录载体和翻译载体：转录载体（包括pET-21 、pET-23 和pET-24 ）表达目标RNA ，但不提供翻译信号。

它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。

（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。

许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于BamH I 位点的GGA 、GAT 和ATC 三联体。

选择要点选择用于表达的pET 载体通常涉及多种因素。

考虑以下三个主要因素：·所表达蛋白的用途·所表达蛋白的已知信息·克隆策略pET 载体表达的蛋白用途各种各样。

例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。

大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。

许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。

如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。

例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。

许多pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。

在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。

LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。

由于许多pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。

采PCR 克隆策略时则有不同的考虑。

LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。

在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。

在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。

PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白(Trx.Tag ) 融合。

新推出的pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白--Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。

此外，trxB 突变株AD494 和BL21 trxB ，或trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。

低温诱导（15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。

为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。

抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用Novagen 的蛋白折迭试剂盒) 。

该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。

然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。

pET-31b （+ ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签如果融合序列不影响应用，生产带有S.Tag 、T7.Tag a 、His.Tag a 和HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。

这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。

通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，GST.Tag 、S.Tag 和T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用S.Tag 和GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。

采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。

它们也特别适用于重新折迭（特别是带有CBD clos .Tag a 序列的pET-34b （+ ）和35b （+ ））。

因为只有正确重新折迭的CBDs 结合到纤维素基质上，CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。

任何标签可用于固定目标蛋白，但由于CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、Trx.Tag 和GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。

Nus.Tag 和Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应pET 载体见列表。

一些pET 载体带有数个***的融合标签，作为5' 融合伴侣。

此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。

使用在5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。

pET-30 Ek/LIC 、pET-32 Ek/LIC 、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。

pET Ek/LIC 载体Combo 试剂盒包括所有4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。