常规细胞培养方法
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是杂交瘤制备单克隆抗体过程中必不可少的实验操作，细胞培养是一个困难重重的事情，多少英雄都在细胞培养上自挂东南枝，本文就细胞培养的步骤及注意事项做一描述。
步骤一、复苏1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5. 3天换一次培养基。
二、传代1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2. 把原有培养基吸掉。
3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。
继续培养。
三、冻存把细胞消化下来并离心（同上）。
用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制： 70%的完全培养基+20�S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
注意事项严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
【1】细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是生物学实验中常见的一项重要技术，它广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
通过细胞培养，科研人员能够研究细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程，同时也可以进行药物筛选、生物学效应观察等实验。
然而，细胞培养是一项复杂的工作，需要严格遵循一系列步骤和要求，并且需谨慎对待各项注意事项。
在本文中，我将以从浅入深的方式，全面探讨细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项，帮助你更深入地理解这一技术。
【2】细胞培养的具体步骤和要求让我们来了解细胞培养的具体步骤。
通常情况下，细胞培养的主要步骤包括：细胞分离、细胞计数、细胞传代、培养基准备、细胞接种、培养条件控制等。
具体来说，细胞培养的步骤包括收获细胞、细胞解聚、细胞计数、调整细胞密度、接种细胞、培养细胞、处理细胞等。
在进行这些步骤时，需要保持实验操作台面清洁整洁，常备所需培养工具、培养耗材和培养试剂，并且要准确记录实验过程中的重要参数和数据。
细胞培养的要求也是至关重要的。
要选择合适的细胞系，确保来源纯净、鉴定正确、培养活力好。
培养基的选用也十分重要，要根据不同细胞类型的需求来选择适当的培养基，并添加必要的生长因子、氨基酸、维生素等。
培养条件的控制也十分重要，包括温度、湿度、二氧化碳浓度、通风情况等。
细胞培养的灭菌和无菌操作更是必不可少，细胞培养过程中的任何污染都可能对实验结果产生影响。
【3】细胞培养的注意事项在进行细胞培养时，需要特别注意一些细节和注意事项。
要保持室内整洁，操作台面、培养箱、生物安全柜等工作台要保持干净，并且要经常消毒。
要做好个人防护工作，戴口罩、手套、工作服等，避免人体细胞对培养的影响。
要定期检查培养箱、生物安全柜等设备的运行情况，确保培养环境的稳定性和安全性。
对细胞的培养时间、传代次数、细胞密度等也需要严格控制，不可随意增加培养时间或传代次数，以免细胞出现突变或异常。
【4】对细胞培养的个人观点和理解从事细胞培养工作多年，我深知细胞培养的重要性和复杂性。
细胞培养方法与步骤
细胞培养方法与步骤细胞培养是指将细胞从一个生物体中取出并在实验室中培养繁殖的过程。
细胞培养可用于各种实验研究，如细胞生物学、分子生物学、药物筛选等。
细胞培养的方法多种多样，下面将介绍常见的细胞培养方法及其步骤。
一、原代细胞培养方法原代细胞培养是指将从组织或器官中分离的细胞直接进行培养。
原代细胞培养是建立细胞株的重要步骤，一般需要一定的技术和设备。
步骤：1.组织分离：从动物或人体中取得组织，如肝脏、心脏等，并用生理盐水或细胞培养基洗刷组织的表面。
2.细胞分离：将组织切割成小块，并用胰蛋白酶或胰酶进行消化，使细胞分散。
3.细胞收集：用细胞培养基冲洗消化后的组织碎片，将细胞收集到离心管中。
4.离心：将离心管放入离心机中进行离心，分离出细胞沉淀。
5.细胞培养：将细胞沉淀重新悬浮在细胞培养基中，然后转移到培养皿中进行培养。
二、细胞株培养方法细胞株培养是指将原代细胞培养到一定数目并进行传代培养的过程。
步骤：1.细胞传代：细胞达到一定密度后，用胰蛋白酶或胰酶等对细胞进行消化，将细胞分离。
2.细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，得到细胞浓度。
3.细胞培养：将分散的细胞与新鲜的培养基混合，然后转移到培养皿中进行培养。
4.细胞增殖：培养皿中的细胞经过一段时间的培养，可以看到细胞开始增殖，形成细胞集落。
5.细胞传代：当细胞集落接近充满培养皿时，需进行细胞传代，即将细胞分散到新的培养皿中。
6.细胞冻存：当细胞达到所需数量后，可以进行细胞冻存，以备之后的使用。
三、细胞培养技术要点1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，避免细菌或真菌的污染。
操作前需做好洗手消毒，使用无菌操作台，并加入适量的抗生素或抗菌剂到培养基中。
2.培养液选择：根据不同细胞的需要，选择适合的培养基和生长因子，以提供细胞的生长所需的营养物质。
3.培养条件控制：温度、湿度、CO2浓度等因素对细胞生长有重要影响，需根据具体要求进行调节。
4.细胞检测：在细胞培养过程中，需要定期观察和检测细胞的形态、生长情况、细胞浓度等指标，以确保细胞的正常生长和状态。
细胞培养方法范文
细胞培养方法范文细胞培养是一种将体外的细胞从一个生物体中取出并放入培养皿或培养室中，提供适宜的环境因素（如温度、湿度、营养物质）使其继续生长和分裂的技术。
细胞培养是生物学研究和生物技术应用中必不可少的一项技术。
下面将介绍常用的细胞培养方法。
1.动物细胞培养方法（1）悬浮培养：适用于悬浮生长的细胞如淋巴细胞、白血病细胞等。
主要是将细胞悬浮在培养基中，通过培养皿的旋转或培养室的搅拌来提供充足的营养物质及氧气。
（2）附着培养：适用于贴壁生长的细胞如肝细胞、肾细胞等。
将细胞悬浮在含有酶的消化液中，提取细胞后将其直接培养在具有黏附性的培养皿中，培养基中含有足够的营养物质以支持细胞正常的生长和分裂。
（3）无血清培养：通过去除培养基中的胎牛血清，使用一些替代品如人血清蛋白、胎儿牛血清等来提供细胞所需的营养物质，减少胎牛血清中可能存在的病毒、细菌等污染物质。
2.植物细胞培养方法（1）培养基选择：对于不同的植物细胞种类，需要选择不同的培养基。
通常的基础培养基有MS培养基、B5培养基等，根据不同的需要可以添加不同的激素和抗生素来调整培养基的组成。
（2）组织培养：将植物的种子、叶片、茎尖、根尖等组织切碎，放入含有培养基的培养皿中，使组织生长、分化和再生。
（3）离子膜培养：将植物细胞分散在带正/负电离子的离子交换膜上，通过电场刺激细胞的分裂和生长，用于增加植物细胞产量和代谢产物。
3.细菌培养方法（1）液体培养：将细菌接种到含有足够营养物质的培养基中，适当控制培养基的pH值、温度和氧气供应，通过转动培养瓶或转座培养容器等方式提供足够的氧气和营养物质。
（2）平板培养：将细菌接种到含有琼脂的平板上，使细菌在琼脂上生长和分裂形成菌落，通过菌落的形态和数量来判断细菌的菌种和数量。
（3）巢式培养：将小量的细菌接种到含有琼脂的小巢中，瞬间加热使琼脂溶化后迅速冷却凝固，细菌会在巢内扩展形成单个菌落，便于鉴定和分离。
4.真菌培养方法（1）固体培养：将真菌菌种接种到含有琼脂的培养瓶中，使其在琼脂上生长和分裂形成菌落。
【高中生物】细胞培养一般方法
【高中生物】细胞培养一般方法1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;2.首先清洁无菌台，然后用75%酒精擦拭，用紫外线照射40分钟以上；各种培养皿辐照3小时以上；3.培养基(ph7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存;4.消化液（pH7.8）或其他添加的液体用高压蒸汽灭菌或用一次性无菌过滤器过滤灭菌，然后分装到支架中-20度储存；5.各种炒娴囊禾甯次率庇ρ咭”呷诨?否则有的液体(特别是培养基)容易产生沉淀.如果培养箱暴露在紫外线下超过6小时，则至少每月一次，在暴露在紫外线下后用清水擦拭7.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点.恢复：1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.2.在无菌台上，将完整的培养基加入50ml的小培养瓶中，约5ml，然后用无菌吸管从冷冻管中取出细胞，放入培养室，轻轻摇动，使细胞均匀，然后放入培养箱中培养传代:1.贴壁细胞：对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后高中三年级,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验.2.悬浮细胞：一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心500rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒2 0分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO 3调整。
8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞培养方法
细胞培养方法细胞培养是生物学实验中常用的一项技术，它可以使细胞在人工环境中生长、繁殖和维持其生理功能。
细胞培养方法的选择对于细胞的生长和实验结果至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法。
1. 细胞培养基的选择。
细胞培养基是细胞培养的基础，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，选择合适的培养基对于细胞的生长和实验结果至关重要。
2. 细胞传代。
细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到一定程度时需要进行传代。
传代的目的是保持细胞的生长状态，避免细胞过度密集导致细胞死亡。
传代的方法包括胰蛋白酶消化、离心、重新接种等步骤。
3. 细胞培养的条件控制。
细胞在培养过程中需要适宜的环境条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常情况下，细胞培养箱是细胞培养的最佳环境，它能够提供恒定的温度、湿度和CO2浓度。
4. 消毒和无菌操作。
在细胞培养过程中，消毒和无菌操作至关重要。
细胞培养器皿、培养基、工具等都需要进行严格的消毒处理，以避免细菌和真菌的污染对细胞培养的影响。
5. 细胞培养的细胞密度控制。
细胞密度的控制对于细胞培养至关重要。
过高的细胞密度会导致细胞之间的竞争和相互抑制，从而影响细胞的生长和实验结果。
因此，需要根据细胞类型和实验要求来控制细胞的密度。
6. 细胞培养的细胞凋亡检测。
在细胞培养过程中，细胞凋亡是一个常见的现象。
因此，需要对细胞进行凋亡检测，以保证实验结果的准确性。
常用的凋亡检测方法包括Annexin V/PI双染和TUNEL染色等。
7. 细胞培养的细胞培养器具和试剂的选择。
在进行细胞培养实验时，选择合适的细胞培养器具和试剂也是非常重要的。
比如细胞培养皿、细胞培养瓶、移液器、吸头等实验器具，以及培养基、胰蛋白酶、抗生素等试剂的选择都会直接影响到细胞培养的效果。
综上所述，细胞培养是生物学实验中不可或缺的一项技术，选择合适的培养基、控制细胞密度、细胞凋亡检测等都是保证细胞培养效果的关键。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
细胞培养方法
细胞培养方法
细胞培养方法是现代生物医学研究的重要手段之一，其主要目的是
将细胞从体内或体外环境中分离出来，在体外条件下使其不断繁殖和
生长，为研究细胞的生理特性、代谢过程以及生长调控等提供理论依据。
下面我们将为大家介绍细胞培养的几种方法：
一、原代细胞培养法
原代细胞培养方法主要是从动物或植物组织中取得一次性的新鲜细胞，通过消化、裂解和筛选等处理方法来获得单个细胞，然后将其置于含
有合适诱导因子、营养物质和生长因子等的培养基中进行培养，使其
逐渐分裂、增殖和扩张，直到达到一定程度的生长阶段。
这种方法适
用于体积小、形态相对简单的细胞，如淋巴细胞、骨髓细胞等。
二、细胞减数分裂技术
细胞减数分裂技术主要是通过对细胞进行化学或物理处理，使其进入
分裂前的减数分裂期，并保留细胞的染色体数目和形状，形成纯化的“重组”细胞，然后将其培养在适当的培养基中进行继续培养和繁殖。
该方法适用于研究细胞的遗传基础、染色体变异和复杂遗传性疾病等
领域。
三、细胞团块培养法
细胞团块培养法主要是将多个细胞聚集在一起形成团块，然后将其接
种入涂有凝胶剂的培养基中进行培养。
该方法适用于培养胚胎干细胞
等对细胞-细胞相互作用和信号传递有一定依赖性的细胞类型。
四、细胞悬浮培养法
细胞悬浮培养法主要是将单个细胞悬浮在培养基中进行培养，而不附
着于固体表面。
该方法适用于研究细胞的分泌代谢、细胞间相互作用、微重力环境对细胞行为的影响等领域。
总之，不同的细胞培养方法适用于不同类型、不同目的的研究，选择
合适的培养方法将有助于高效地进行科学研究和疾病治疗。
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
实验总结-细胞培养方法
一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：10 % DMSO + 90%依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min二、细胞复苏步骤：1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
超净台内准备一支15ml离心管备用。
3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项：1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞培养流程及注意事项
细胞培养流程及注意事项COOKCELL一、细胞培养概念细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。
细胞培养可分为原代培养和传代培养；直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器（同样底面积的容器）中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
二、细胞复苏1、细胞复苏遵循“慢冻快融”的原则，所以细胞冻存管从液氮中取出后，稍等待液氮挥发后，将冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动融化（约1min）2、吸取细胞混悬液加入离心管，800rpm离心3min，弃去上清3、加入对应细胞的完全培养基，重悬细胞，再以5x105个/ml细胞接种至培养瓶/培养皿中4、放入37℃培养箱中，CO2 5%培养，定时观察细胞培养情况三、细胞冻存1、悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清2、贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃孵育2-3min（对于新培养的细胞，建议消化时每隔30s镜下观察消化情况，以确定合适的消化时间），加入含血清完全培养基终止消化，用移液器吸取瓶内液体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重复2-3次，将细胞悬液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清3、加入冻存液：加入细胞冻存液（最好是用10% DMSO 完全培养基冻存细胞）重悬细胞，使细胞浓度在（5～10)×105个/ml，然后分装到冻存管中4、程序降温盒：4℃放30min → -80℃ 过夜（至少4-8h）→ 液氮（长期保存）5、温馨提醒：4℃ 30min这个步骤一定不能省略，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损；细胞-80℃保存不要超过一个月，长期保存要放在液氮中，保持细胞活性赛库生物的细胞每一个批次都会进行一次支原体和STR检测四、细胞传代1、悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清，加入新鲜的含血清的完全培养基，用吸头小心重悬细胞，按细胞生长密度将细胞悬液均匀分配到培养容器中进行传代培养2、贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃孵育2-3min，加入含血清完全培养基终止消化，用移液器吸取瓶内液体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重复2-3次，将细胞悬液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清，加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液，按细胞生长密度将细胞悬液均匀分配到培养容器中进行传代培养3、将培养容器放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞生长情况4、温馨提示：细胞传代需等面积按比例传代，如T25培养瓶培养，需1:2传代，应是将细胞悬液分为两份各加入T25培养瓶中进行培养五、注意事项1、细胞的冻存和复苏一定要遵循“慢冻快融”的原则，最大限度的保证细胞活性2、培养皿/培养瓶/培养板选择：贴壁细胞培养选用TC处理的3、使用L-15培养基时，培养瓶要用非透气盖的培养瓶，因为L-15培养基的成分会与CO2反应4、细胞培养换液：一般2-3天换液，有的细胞生长速度慢，可适当延长，但是也不要超过7天换液，如果换液后培养基快速变黄，则大概率是细胞被污染5、培养细胞最适PH为7.2-7.4，过酸、过碱会导致细胞形态发生异常，甚至死亡6、细胞密度达到70%-80%汇合度，此时处于对数生长期，最适合传代7、当细胞出现污染时，细菌污染可视污染程度决定是否加抗生素挽救，真菌污染和支原体污染建议不要（除非细胞很珍贵，难获得），当出现污染需要加抗生素处理时，在开瓶前需要把所有东西都准备好，并将操作台上无关的用品移走，避免造成二次污染8、移液废液缸建议外置，内置废液缸易引入污染9、在超净台/生物安全柜操作时左右手不能交叉，放置实验用品时需75%乙醇消毒再放入，严格按照操作规范进行。
常用细胞培养方法整理
常用细胞培养方法整理细胞培养是一种在体外培养细胞的技术，广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。
常用的细胞培养方法包括原代细胞培养、细胞系培养、体外血管生成实验和三维培养等。
1.原代细胞培养原代细胞培养是从组织中分离和培养原始细胞的方法。
常用的原代细胞包括肝细胞、肺细胞、心肌细胞等。
通常，将组织样品切碎并用酶溶解，然后通过筛网过滤，以分离单个细胞。
分离的细胞可以通过离心或贴壁培养等方法进行培养。
2.细胞系培养细胞系培养是一种从原代培养细胞中建立的“永生”细胞系。
常用的细胞系有HEK293细胞、HeLa细胞等。
一般来说，细胞系生长速度更快且更易于培养。
细胞系培养常用的方法包括贴壁培养、悬浮培养和旋转培养等。
3.体外血管生成实验体外血管生成实验是一种研究血管生成过程的常用方法。
通过培养内皮细胞和其他细胞在三维基质中形成管状结构，模拟体内血管生成的过程。
这一方法被广泛应用于研究血管生成的机制、药物筛选和治疗的评估。
4.三维培养三维培养是一种在三维基质中培养细胞的方法，模拟细胞在体内的生长环境。
相对于传统的二维培养，在三维培养中，细胞能够形成更复杂的结构和组织，更贴近真实生理情况。
这一方法被广泛应用于组织工程、疾病模型的构建和药物筛选等研究领域。
除了上述常用的细胞培养方法外，还有一些其他的方法也值得关注。
例如，共培养是一种将不同类型的细胞一起培养的方法，用于研究细胞间相互作用。
过去，常规的细胞培养方法主要是在培养皿中进行，但现在也发展出了一些其他容器，如微流控芯片和生物反应器等，用于更精确地控制和监测细胞培养的环境。
细胞培养是现代生物学研究不可或缺的一部分，不断发展和改进的细胞培养方法为科学家们提供了更丰富和多样的工具，以便更好地理解细胞的生理机制和生命过程。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
1
细胞培养基本方法(复苏、换 液、传代、冻存)
2
一 原代培养（略）
3
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
4
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分 钟后方可进入实验室.
2. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 3. 带手套,并用酒精擦拭之. 4. 准备好实验必需用品. 5. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 6. 超净工作台内操作完成后，
注意：
保护自己； 先将重铬酸钾完全溶解于水中（必要时可加热帮 助溶解），然后缓慢加入浓硫酸，以免产生热量 太多，使容器破裂。
26
噻唑蓝MTT液配制
方法
1. 称取25mgMTT, 加入5ml PBS液, 混匀, 即成5mg/ml的 MTT液；
2. 用0.22µm的微孔滤器除菌, 避光, 4℃保存一周内使用.
21
RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml， 在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；
2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-
36%-38%的浓HCL到5%的稀HCL的配制比 例为3:17，
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数
方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术
细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术细胞生物学是研究细胞结构、功能、分类、发育以及细胞在生命过程中的相互关系等方面的学科。
在细胞生物学中，细胞培养技术是非常重要的一项技术，它可以在无菌的条件下培养、保存细胞，并且可以进行细胞的分离、纯化、鉴定、增殖、转染、诱导分化等操作，为细胞生物学的相关研究提供了基础。
下面将介绍细胞生物学中最常用的5种细胞培养技术。
一、传统细胞培养技术传统细胞培养技术是指利用培养皿、培养基、培养室等基础设施进行培养的技术。
该技术可以较好地维持细胞在体外的生长状态，使细胞克隆化、鉴定、扩增、分化或合成合适的基质，为多种生物学研究提供了必要技术手段。
在传统的细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：组织细胞均一器、离心机、洗涤机、常规培养基、游离胰酶、胎牛血清等。
此外，对控制环境影响也有严格的要求，如细胞培养应在静态的无菌条件下进行，避免各种污染的发生。
二、悬浮细胞培养技术悬浮细胞培养技术是指通过将细胞放入含有细胞培养基的培养器中，维持细胞在悬浮状态下进行培养的一种技术。
悬浮细胞培养技术的研究对象包括动物细胞、植物细胞和微生物等。
在悬浮细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：旋转培养器、搅拌培养器、细胞培养基、血清替代物、培养室等。
在进行悬浮细胞培养的同时，需要注意对培养环境进行有效控制，确保培养过程无杂质、无致病微生物的入侵。
此外，控制培养器内悬浮颗粒的所占比例、含氧量和温度等因素也是进行悬浮细胞培养的重要技术手段之一。
三、三维细胞培养技术三维细胞培养技术是指通过结构性的材料基质，将单个细胞或者成簇的细胞培养为3D的立体结构，使其能够模拟生物体内的细胞环境并进行培养的一种技术。
与传统2D平面细胞培养技术相比，三维细胞培养技术更能反应生物体内的细胞环境，对有些细胞生长的形态、功能和表达特性的研究也更有优势。
在三维细胞培养技术中，涉及到的主要设备和试剂有：支架材料、重量材料、培养基、细胞培养器等。
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常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养
原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：动物组织块
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒
初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。
4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。
8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法
1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。
2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。
3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。
4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。
置温箱中静止培养。
待细胞从组织块游出数量增多后。
再补加培养液。
传代培养法
原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
材料和试剂
1.细胞：贴壁细胞株
2.试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）
3.仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
操作步骤
1.吸除培养瓶内旧培养液。
2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。
3.置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4.吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。
注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。
5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6.计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
无菌操作注意事项
1.操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。
试剂等瓶口也要擦试。
2.点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5.瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。
6.吸溶液的吸管等不能混用。