超氧化物歧化酶

welc氯om仿e-乙to醇u混se合th液ese PowerPoint templates, New
Con邻ten苯t 三de酚sign, 10 years experience
浓盐酸仪器：
天平、 石英砂、 研钵、 冷冻离心机、
50mL
离心管 （ 8）、 紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶
（8个）、 玻璃棒 （8根）、 试剂瓶250mL（3个）、
SOD的作用
welcome to use these PowerPoint templates, New Cont它en催t d化e超sig氧n阴, 1离0子ye转a化rs为exHp2eOr2ie和ncOe2的反应， 即催
化超氧阴离子自由基O2-·发生歧化反应， 从而清除O2-·， 2O2-·+2H+→H2O2+O2， 在生命体的自我保护系统中起 着极为重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功，因而 它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。
OD2
பைடு நூலகம்
OD2
PH8.3缓冲液 3
3
3
3
3
SOD提取液 0
0
0.1
0.1
0.1
蒸馏水
2
1.8
1.7
1.7
1.7
室温放置20min
邻苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
结果计算
酶活力单位 提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1= 粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1= 酶液活力单位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
500mL （ 3个）、250mL烧杯 （16个）、试管带胶
塞(80根)、移液管(5根)
SOD的生产
1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，
加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继 续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后 6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。
45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的 范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成 O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测 定光吸收即可求出SOD的酶活性。
实训器材
大蒜，冷丙酮 ， 磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)
取1.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入3ml 酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀
空白：取1.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温 15min, 加入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇
匀
计算加酶后连苯三酚自氧化速率
试剂/ml
SOD的生产
空白 对照管 提取液 粗酶液 酶液
管
OD1
OD2
大量试验和临床应用表明， 无论何种给药方式，除罕 见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在 30 000以上的蛋白质， 但却未发现具有抗原性， 其原因 也正在进一步研究中。
2.SOD生产时的注意事项
2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底
2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度计
超氧化物歧化酶(SOD)的生产
第六组 钱龙
SOD知识简介
1.SOD的概念 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的
金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。
2.SOD的分类 按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-
SOD三种
SOD知识简介
3.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使 CuZn-SOD 和 Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响
2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿——乙醇混合液搅拌
15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清 液即是粗酶液
SOD的生产
3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，
持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉 淀
总活力 提取液总活力U=活力单位×总体积= 粗酶液总活力=活力单位×总体积= 酶液总活力=活力单位×总体积=
比活力 提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度= 粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度= 酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=
注意事项
1.SOD的安全性
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实训目的
（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯 化倍数。
3）掌握离心机的使用。
实训原理
welco邻m苯e三to酚u在se碱t性he条se件P下o，we能rP迅o速in自t te氧m化p，lat释es放, 出New COo2n-，ten生t成de带si色gn的, 中10间y产ea物rs，e中xp间er物ie的nc积e累在滞留30～
空白：取4.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min, 加入 10 缓冲液，迅速摇匀
倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中 每隔30s测A值一次
计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自 氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min
酶活测定
测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同
3.2 SOD的吸收光谱特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和
酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。 CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右，
这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。
SOD知识简介
3.3 SOD稳定性及影响因素
3.3.1 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.3～9.6间催化性能 良好，在pH4.5～pH11间能稳定存在。pH3.6时， CuZn-SOD 中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的 转变而使酶失活。 3.3.2 SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度 很低时,即使加热到95℃, 其活性损失也很少其他因素：SOD活 性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响， 只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还 发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用
4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中， 然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用 凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。
SOD的生产
5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量
6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。
连苯三酚自氧化速率的测定
取4.5ml缓冲液，在25℃水浴中保温15min,加入10 连苯 三酚液，迅速摇匀