PCR引物设计方法综述_尤超

2.1
进行引物设计的主要数据库和生物软件 目前 ， 进行引物设计时模板选择有 2 种情况 ： 一种是扩
增 已 知 基 因 ， 需 要 在 GenBank 数 据库 中 搜 索 相 同 物 种 该 基 因的 DNA 或者 mRNA 作为模板来设计引物 ； 另一种是扩增 未知基因 ， 需根据比较基因组定位的原理 ， 选择研究深入的 高 等 动 植 物 保 守 的 功能 基 因 的 DNA 或 者 mRNA 序 列 为 模 板来设计引物 [8]。 虽然引物设计模板选择有很多 ， 但是无论何种情况 ， 都 要涉及引物设计软件 。 通过搜集大量的信息资源 ， 当前进行 引 物 设 计 的 国 际 三 大 核 酸 数 据 库 分 别 为 NCBI （http ：//www.
收稿日期
2011-07-04
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尤 超等 ：PCR 引物设计方法综述
codehop.htm ）、clustalW2 （http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/ index.html）、Vector NT I Suit、Dnasis Omig a、Dnastar、DNAMAN、 Oligo6.0 等 [9]。
[1]
内切 酶 的 酶 切 位 点 [5]，百度文库有 利 于定 向 克 隆 ， 加 入 的 酶 切 位 点 不 能与引物内部形成互补结构 [6]， 并且所选择的酶切位点尽量 为 多 克 隆 位点 的 中 间 酶 切 位 点 ， 最 好载 体 其 他 地 方 无 该 酶 切位 点 。 这 样 连 接 以 后 再 构 建新 的 质 粒 时 选 择 酶 的 空 间 更 大 些 ， 并 保 证 所 需 扩增 的 DNA 序 列 中 无 该 酶 切 位 点 ， 为 日 后研究该基因的后续实验奠定基础 。 通常 情 况 下 ， 研 究 者 进 行 引 物 设 计 的 基 因 涉 及 到 很 多 种类型 ， 既有结构基因又有非结构基因 ， 结构基因和非结构 基因又包括多个基因 ， 都必须综合分析 。 以上便是研究具体 基 因的 目 的 及 意 义 ， 即 所 设 计 引物 的 基 因 必 须 要 在 相 关 领 域有自身的研究和应用价值 。
2
引物设计总体概述 并不 是 所 有 研 究 都 有 可 以借 鉴 的 通 用 基 因 。 由 于 所 探
宗旨和意义 ， 首先要查阅大量的文献 ， 明确该基因的相关理 化特性 。 以研究银杏的顺式 - 异戊烯基转移酶 （cis-prenyltran
索 的科学问题不同 ， 突破点和侧重点也就不一样 ， 往往就需 要根 据 不 同 的研 究 目 的 和 意 义 进 行 引物 设 计 。 如 研 究 植 物 的 多倍化与杂交 ， 就需要设计单拷贝核基因的引物 ； 而研究 多基 因 家 族 进 化 ， 就 需要 设 计 可 以 扩 增 这 一 基 因 家 族 不 同 基因的引物等 [7]。
sferase ，CPT ） 为 例 ， 通 过 相 关 文 献 了 解 到 ， 它 是 聚 戊 烯 醇 合
成的 第 一 个 关 键 酶 ， 分 别 从法 尼 基 焦 磷 酸 （Farnesyl pyropho
sphate，FPP）或牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸 （Geranylgeranyl pyrophosphate ，GGPP ） 形 成 聚 戊 烯 醇 、 甾 醇 、 类 胡 萝 卜 素 、 叶 绿
YOU Chao
Review of the PCR Primer Design Method ZHAO Da-qiu LIANG Cheng-bang ZHOU Chun-hua *
（College of Horticulture and Plant Protection ，Yangzhou University ，Yangzhou Jiangsu 225009 ） Abstract In order to obtain an ideal method of PCR primer design ，the author completed primer design of target gene ，using some databases and software tools for primer design ，such as NCBI ，Primer Premier 5.0 and so on ，combined with the principle of primer design.Then made a research on optimization of conditions for PCR reaction after the designed primer was analyzed through BLAST comparison ，comprehensive evaluation and gene retest analysis. The results indicated that primers designed through these databases and softwares could basically meet the requirements of following RTPCR reaction ，and could make an in-depth study of molecular biology. Key words PCR ；primer design ；software；molecular biology
获取序列 （NCBI ，Gramene ，EBI 等 ） 序列编辑与整理 （DNA star ，DNAMAN 等 ） 确定引物设计的位置 （Blastn/p ，ClustalW 等 ） 引物设计 （Primer premier 5.0 ， 简称 PP 5 等 ） 获取序列 （NCBI ，Gramene，EBI 等 ） 引物特异性比对及综合评价 （Blastn ，Oligo 6.0 等 ）
File 菜 单 中 选 择 Eenter Sequences ， 在 查 找 范 围 对 话 框 中 将
上述获得的目的序列复制 ， 点击 Done ， 软件就自动把输入的 所有序列进行比较 ， 确定同源性区域 。 找出同源性较高的区 域 ， 在该区域内选择出引物设计的模板 [12]， 通过以 上 的 计 算 机操作便可以完成图 1 所示的序列编辑与处理以及引物设 计位置的确定 。
作者简介
ncbi.nlm.nih.gov）、DDBJ （http：//www.ddbj.nig.ac.jp）、EMBL （http： //www.ebi.ac.uk/embl ）， 生物软件 有 ：BlockMaker （http：//blocks. fhcrc.org/blocks/makeblocks.html 或 http：//blocks.fhcrc.org/block mkr/makeblocks.html ）、CodeHop （http ：//blocks.fhcrc.org/blocks/
聚 合 酶 链 式 反 应 （Polymerase chain reaction ，PCR ） 是 20 世纪后期发展起来的一种体外扩增特异 DNA 片断的技术 ， 具有快速 、 简便及高度敏感等优点 ， 能极大地缩短目的基因 扩 增 时 间 。 因 此 ， 其 一 直 是 生 物 学 者 们 致 力 于 构 建 cDNA
素 、 萜类 、 泛醌等物质 。 目前对 CPT 的研究较少 ，Oh 等 [4]从拟 南 芥 中 分 离 和 鉴 定 了 CPT ， 而 NCBI 中 尚 无 银 杏 CPT 序 列 的记载 ， 通过从银杏叶 中 克 隆 CPT 进 行 基 因表 达 调 控 和 功 能 分 析 研究 ， 对 于 探 讨 银 杏 聚 戊 烯 醇的 合 成 代 谢 具 有 重 要 的意义 。 其次 ， 在 进 行 引 物 设 计 之 前 必 须 弄 清 楚 是 否 要 进 一 步 用于克隆或表达 。 若要用于克隆 ， 引物 5′ 端最好加上限制性
2.2
设计原则 虽然 引 物 设 计 软 件 种 类 很多 ， 但 其 引 物 设 计 必 须 遵 循
以下基本原则 。
2.3.3
使 用 Primer Premier 5.0 设 计 引 物 。Primer Premier 5.0
2.2.1
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结
是用来设计最适合引物的应用软件 ， 利用其高级引物功能 ， 进行 引 物 数 据 库 搜 索 、 巢 式引 物 设 计 、 引 物 编 辑 和 分 析 等 ， 可以设计出有高效扩增能力的理想引物 ，也可以设计出用于 扩增长达 50 kb 以上的 PCR 产物的引物序列 。该软件主要由
文 库 、 基 因 克 隆 以及 表 达 调 控 研 究 的 必 要前 提 和 基 础 [2]。 近 年来 ， 该技术在相关领域得到了广泛应用 ， 并大大推进了分 子生物学和相关领域的研究和发展 。众所周知 ，引物设计是影 响 PCR 试 验 的 重 要参 数 之 一 。 目 前 ， 虽 然 引 物 设 计 软 件 的
另外 ， 笔者通过搜集资料发现 ， 现在引物设计还可以直 接登录 http：//www.idtdna.com/Home/Home.aspx，在 SciTools的 下 拉 菜 单 中 直 接 选 择 PrimerQuest ， 然 后 弹 出 相 关 的 操 作 界 面 ， 最 后 研 究 者根 据 所 研 究 的 目 的 和 意义 进 行 针 对 性 的 计 算机引物设计程序操作 。 设计 引 物 的 软 件 一 般 都 具有 引 物 自 动 搜 索 功 能 ， 不 同 软 件 侧 重 点 有 所 不 同 。 因 此 ， 自 动 搜 索 的 结 果 也 不一 样 。 一 般以 Premier Primer 5.0 功能最强且方 便 使 用 ， 其 次 是 Oligo
农业基础科学
现代农业科技
2011 年第 17 期
PCR 引物设计方法综述
尤 超 赵大球 梁乘榜 周春华
*
（ 扬州大学园艺与植物保护学院 ， 江苏扬州 225009 ）
摘要 为了获得 PCR 引物设计的理想方 法 ， 笔 者 运用 NCBI 等数 据 库与 引物 设 计软 件 Primer Premier 5.0 等 工 具 ， 结 合引 物 设计 的原 则 ， 完成目的基因的引物设计 ， 并对设计后的引物进行 BLAST 比对 、 综合评价和基因的重新检测等分析 ， 据此对 PCR 反应条件进行优化研 究 。 结果表明 ， 通过这些数据库和软件所设计的引物能基本满足后续的 RT-PCR 反应 ， 可以进行进一步的分子生物学研究 。 关键词 PCR ； 引物设计 ； 软件 ； 分子生物学 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1007-5739 （2011 ）17-0048-04
基金项目 江 苏 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （BK2008213 ）； 江 苏 省 教 育 厅 高 校 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （08KJD220002 ）； 扬 州 大 学 科技创新培育基金资助项目 （2007CXJ018 ，2009CXJ030 ）。 尤超 （1987- ）， 男 ， 安徽灵璧人 ， 在读硕士研究生 。 研究方向 ： 银杏次生代谢调控 。 * 通讯作者
[3]
功 能 都 非 常 完善 ， 但 是 关 于 计 算 机 引 物设 计 程 序 的 文 献 还 不多 ， 初学者具体操作起来还是会觉得比较复杂 ， 该文拟对 引物设计的原则和软件的使用方法进行深入地探索和分析 。
1
具体基因引物设计的目的和意义 在准 备 基 因 引 物 设 计 前 ， 要 非 常 清 楚 地 了 解 其 研 究 的
PCR 扩增试验验证 （ 凝胶成像系统 ）
图1
引物设计流程
进行序列比较 ， 具体步骤为打开 DNAStar ， 点击 MegAlign ， 在
6.0 ， 其他软件如 Vector NT I Suit 、Dnasis Omiga 和 Dnastar 等
都带有引物自动搜索功能 ， 但搜索结果都不是十分理想 。 当 然 ， 要想得到效果很好的引物 ， 在自动搜索的基础上还要辅 以人工分析 [10]。