基因表达应用示例

基因表达应用示例

通过实时荧光定量PCR 技术实现对miRNA 靶向物mRNAs 的相对定量分析

1 导言

小RNA （miRNAs ）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA ，它们是许多基础的细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等。miRNA 在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA 通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而，在靶向mRNA 降解水平上的基因表达的调控已有报道。因此，有证据显示miRNA 能够通过RNA 降解来实现对细胞内mRNA 浓度的直接调控，而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来调控mRNA 水平，这些蛋白质级联能够调控下游转录或在转录后对mRNA 水平进行调控。

在当前的研究中，我们重点关注miRNA hsa （人）miR-21，研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中miR-21水平上调。更进一步的研究发现，miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21进行研究，我们研究了miR-21的水平对三个假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN 和TLR2）mRNA 表达的影响（见图1）。

2 材料和方法

细胞培养

DMEM培养基中补充1%的L-谷氨酰胺，1%的盘尼西林/链霉素，10%的FBS，在+37℃5%CO2条件下培养HeLa细胞。用miRNA 21 miRIDIAN类似物，miRNA 类似物miRIDIAN对照，miRNA 21 mi RIDIAN抑制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNA （dhar-macon都为50nM），以及X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），按照生产商的方案进行转染。

RNA提取与逆转录

在转染之后两天，使用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司），按照生产商的建议从HeLa细胞中提取总RNA（每个类似物miRNA三个生物学复制）。同时，使用High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司），按照使用说明书上的指导，提取包含小分子量RNA在内的总RNA（两个生物学重复）（见图2）。按照生产商的指导，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）和oligo（dT）18与随机六聚体引物的混合物，按照每次反应500到1000ng总RNA的量进行第一链cDNA的合成。用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit（Exiqon）进行miRNA 第一链cDNA的合成，每次反应使用4ng含有小RNA在内的总RNA。qRT-PCR

基因表达分析

在384孔板上11ul/孔的总反应体积中，使用荧光Universal ProbeLibrary（UPL）探针（罗氏公司）和ABI 7900HT 实时仪器（美国应用生物系统公司）以及2X FastStart Universal Probe Master （Rox）PCR试剂（罗氏公司）进行定量RT-PCR。每次反应的cDNA/RNA浓度为10ng。ABI 7900HT实时仪器（美国应用生物系统公司）的PCR条件如下：+95℃下变性15分钟，+95℃下扩增15秒，最后在+60℃下延伸60秒。

miRNA定量

使用LightCycler? 480实时荧光PCR仪（罗氏公司），在384孔板的模式下，设定反应体积为20ul，以1:10梯度稀释cDNA，在miRCURY LNA SYBR Green master mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和miR-21的LNA PCR引物（Exiqon）的共同作用下进行miRNA qRT-PCR. LightCycler? 480仪的PCR条件如下：95℃变性10分钟，95℃变性10秒，60℃延伸20秒，反应设40个循环。使用△△Ct方法（Livak 和Schmittgen，2001年），用HPRT1和GAPDH 作为参考（管家基因）基因，来反映假定的靶向基因表达水平上的成倍变化。对于has miR-21，则用非靶向合成类似物-和抑制剂-miRIDIAN作为miRNA转染HeLa细胞的实验对照。

培养HeLa细胞

用miRNA miRIDIAN类似物和miRNA类似物miRIDIAN 对照，以及miRNA 21miRIDIAN抑制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNA转染HeLa细胞。

提取miRNA提取总RNA

qRT-PCR-miRNA定量qRT-PCR-基因表达分析图1：利用假定的miR-21靶向基因（PDCD4，PTEN 和TLR2）的表达水平分析从而对has miR21进行分析的工作流程。

图2：用指定试剂（miRIDIAN miRNA类似物或miRIDIAN miRNA抑制剂）转染HeLa细胞后，用Agilent生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量RNA 进行凝胶电泳。

3 结果和讨论

为了分析miR-21水平升高对靶向基因（PDCE4，PTEN和TLR2）的mRNA水平的影响，我们使用UPL通用探针库探针（罗氏公司）和ABI 7900HT实时PCR仪（美国应用生物系统公司）对已经报道的能够被miR-21调控的一些mRNA的丰度进行了定量测定。使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），用miR-21的类似物和抑制剂对HeLa细胞进行转染，并分别设置（miRNA 21 miRIDIAN类似物对照，miRNA miRIDIAN类似物对照，miRNA 21抑制剂和miRNA抑制剂对照siRNAs）。miRIDIAN miRNA类似物是一种合成的双链结构，能够代表对靶向mRNAs进行调控的成熟miRNAs，与内源性miRNAs类似。与之相反，miRIDIAN miRNA抑制剂是一种不可水解的成熟miRNA的反向互补单链，在转染细胞之后能够降低内源性miRNAs的活性。这极有可能是由于抑制剂与成熟miRNA之间进行不可逆结合造成的（Meister, Landthaler等，2004）。

我们在LightCycler? 480（罗氏公司）上进行qRT-PCR，对miR-21的miRIDIAN类似物和抑制剂对成熟miR-21水平的影响进行了定

量测定。使用High Pure miRNA Isolation Kit （罗氏公司）提取miRNA，用qRT-PCR与miRCURY LNA进行定量检测，并用小分子量非编码核仁RNA SNORD44进行校准。与用miRIDIAN类似物处理的对照细胞相比较，用50nM miR-21的miRIDIAN类似物转染细胞后，HeLa细胞中miR-21的浓度上升了7.3倍（见图3）。与之相反，用50nM miR-21的miRIDIAN抑制剂转染HeLa细胞后，miR-21水平下降了77%（见图3）。这表明，X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）是一种非常好的转染工具，能够有效地将miRIDIAN类似物和miRIDIAN抑制剂转染到目标细胞中。而且我们还发现，High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司）能够有效地提取miRNA，并用于之后miRNA浓度的分析。

在使用miRIDIAN类似物和抑制剂上调和下调细胞内miR-21浓度之后，我们对miR-21公认的靶向mRNAs（PDCD4，PTEN 和TLR2）的表达水平进行了研究。在用miR-21的类似物和抑制剂以及各自的对照物感染HeLa细胞两天之后，用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司）提取总RNA。在ABI 7900HT（美国应用生物系统公司）上使用qRT-PCR和UPL通用探针库探针对mRNA 水平进行定量测定，并与对照基因（管家基因）HPRT1和GAPDH正常的基因表达水平进行比较。我们发现，与对照组相比，miR-21的过度表达导致PDCD4（编码人致瘤性转化抑制物）的mRNA水平显著下降了29%（见图4）。最近的研究发现，mi-R-21过度表达能够在蛋白质水平和mRNA水平上对PDCD4基因造成影响（Frankel，Christoffersen 等人，JBC，2008，283），该实验的结果进一步证实了这一发现。

与之相反，在PTEN 的mRNA（编码人同源性磷酸酶-张力蛋白）水平上没有观察到miR-21的影响。在上调或下调miR-21水平之后都是这种情况（见图5）。最近的研究发现miR-21能够通过影响翻译过程而在蛋白质水平上对PTEN产生影响，而PTEN mRNA 水平则不发生变化（Wickramasinghe 等人，2009，NAR）。我们的研究与这一发现相符。有意思的是，与抑制剂转染对照细胞相比，在用miR-21抑制剂转染细胞之后，TLR2（编码toll样受体2）mRNA水平显著下降了57%（见图6）。miR-21和TLR2都在细胞凋亡调控过程中发挥作用，TLR2可能是miR-21抗细胞凋亡活动的重要介质。TLR2是miR-21活性的直接还是间接靶向基因尚不清楚，仍有待研究。

miR21抑制剂miR21类似物miR21抑制剂miR21类似物

图3：miR-21表达的高水平变化。图中显示的是在miR-21抑制（黄色条）或过表达（蓝色条）之后的miR-21水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。图4：miR21对PDCD4基因表达的调控。mRNA-21过表达（蓝色条）导致PDCD4 mRNA 水平下降，而miRNA-21下调（黄色条）并不影响PDCD4的mRNA水平，分别与各自的抑制剂和类似物对照转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。

miR21抑制剂miR21类似物miR21抑制剂miR21类似物

图5：miR21水平调节对PTEN基因表达的影响。当细胞内miRNA-21浓度发生变化时，PTEN RNA的mRNA水平并不发生变化。图中显示的是分别在miRNA-21过表达（黄色条）和miRNA-21抑制（蓝色条）之后PTEN基因mRNA 的表达水平，分别与各自对照的抑制剂和类似物转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。图6：miR-21水平调节对TLR2基因表达的影响。miRNA-21抑制（黄色条）并不会影响TLR2 mRNA水平，而miR-21过表达（蓝色条）会导致TLR2 mRNA水平下降，分别与各自对照的抑制剂和类似物转染细胞（红色虚线=1.0）进行比较。

表

达

倍数

变化表

达倍数

变化

表

达

倍数

变化表

达

倍数

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4 结论

在该研究中，我们分析了hsa miR-21对三个公认的靶向基因（PDCD4，PTEN 和TLR2）在mRNA表达水平上的影响。人miR-21应答通过外源性miRNA miRIDIAN 类似物和抑制剂（Dharmacon）进行调控，使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）能够轻松实现类似物与抑制剂向HeLa 细胞的转染过程。

为了分析miR21水平，罗氏公司的High Pure miRNA Isolation Kit为之后进行

qRT-PCR扩增提供了高质量的模板。该扩增过程用miRCURY LNA First-strand cDNA试剂盒，miRCURY LNA SYBR Green Master Mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和LNA miR-21 PCR引物（Exiqon），在LightCycler? 480实时荧光PCR仪（罗氏公司）上进行。

为了对假定目标基因进行基因表达分析，我们在工作流程中使用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司）进行RNA提取，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）进行逆转录，并用通用探针库探针UPL和FastStart Universal Probe Master（Rox）试剂（罗氏公司）和ABI 7900HT （美国应用生物系统公司）在调控细胞内miRNA之后对mRNA水平进行定量测定。

综上，该基因表达分析的工作流程程序易于建立，并且足够灵敏，能够检测到由一般miRNAs引起的mRNA水平的细微变化，适合相关miRNA表达调控研究的参考。

参考文献

1. Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25, 402-408.

2. Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA, 10, 544-550.

3. Frankel, L.B., Christoffersen, N.R., Jacobsen, A., Lindow, M., Krogh, A. and Lund, A.H. (2008) Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem, 283, 1026-1033.

4. Wickramasinghe, N.S., Manavalan, T.T., Dougherty, S.M., Riggs, K.A., Li, Y. and Klinge, C.M. (2009) Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res.

X-TREMEGENE，LIGHTCYCLER，HIGH PURE和FASTSTART为罗氏公司商标。ProbeLibrary和LNA是丹麦Vedbaek Exiqon A/S公司的注册商标。

SYBR是分子探针有限公司的注册商标。

miRIDIAN是Dharmacon公司的商标。

其他商标或产品名称为其各自所有者的商标。