分子量及分子量分布检测方法

分子量及分子量分布检测方法

1 范围

本标准规定了用高效体积排阻色谱法（HPSEC)测定可溶性聚乳酸平均分子量（Mw）和分子量分布的方法。

本标准适用于外科植入物用，能被三氯甲烷（或其他溶剂）完全溶解的包括聚（L-乳酸）树脂（或缩写PLLA）、聚（D-乳酸）树脂（或缩写PDLA）、任何比率的DL型共聚体以及丙交酯（或缩写PLA）和丙交酯-乙交酯共聚物（或缩写PLGA）的材料。

注1：本方法不是绝对的方法，要求使用市售窄分子量分布聚苯乙烯标准物质进行校正。

注2：由于聚乳酸产品在生产加工及灭菌过程中（特别是辐照灭菌），会影响材料本身的分子量及分子量分布，因此在评价产品时，宜采用成品进行检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 2035-2008 塑料术语及定义

3 术语、定义

GB/T 2035-2008界定的以及下列术语和定义适用于本文件

3.1

聚乳酸 polylactic acid,PLA

包括聚（L-乳酸）树脂（或缩写PLLA）、聚（D-乳酸）树脂（或缩写PDLA）。

3.2

丙交酯-乙交脂共聚物 polylactic acid- polyglycolide acid copolymer，PLGA

由丙交酯及乙交脂按一定比例共聚得到的高分子化合物。

4 方法概要

溶解于溶剂的聚乳酸样品注入填有固体基质的色谱柱，按照溶液中聚合物分子大小顺序分离。自进样开始检测器持续监测从柱中出来的洗脱时间，从柱中流出分子按照尺寸分离，并按照其浓度分离的分子量被检测和记录。通过校正曲线，洗脱时间可以转为分子量，样品的各种分子量参数可由分子量/浓度数据计算得出。

5 试剂和材料

5.1 溶剂：本方法推荐使用三氯甲烷（CHCl3）。任何与HPSEC系统组分和柱填料相容的溶剂，并且可溶解聚乳酸样品的溶剂均可以考虑使用。选择溶剂应考虑试剂的纯度和一致性，例如四氢呋喃易与氧气

发生氧化反应，因此四氢呋喃应添加抗氧剂（含量为0.025%～0.1%的2,6-二叔丁基对甲苯酚）或持续搅拌或用惰性气体防止氧化发生。

5.2 聚合物标准物质：单分散、已知分子量的窄分子量分布聚苯乙烯标准品（分子量分布M w/M n小于1.1）用于校正。

5.3 聚合物标准溶液：配制2～4个混合标准溶液，含有2～3种基线分离的标准品、至少5种窄尺寸分布的聚苯乙烯标准品，每种成分的质量浓度参考所用标准品的说明书中建议的浓度进行配置。标准品在室温下溶解（至多3天），聚合物标准品溶液配制后可在常温中使用1个月。稳定的聚苯乙烯溶液室温时可储存数月。

6 仪器

6.1 凝胶渗透色谱仪：主要组件有溶剂储存器、泵、溶剂脱气装置、进样器、填充柱和溶质检测器。

6.2 磁力搅拌器或类似仪器。

7 分析步骤

7.1 仪器性能要求

7.2 塔板数

塔板数N是无量纲，与柱效和色谱系统中分散过程相关。多种程序和方法用于估算塔板数N。HPSEC 色谱柱要求等于或超过10000塔板数/m。塔板数应定期检测，及时更换不符合性能要求的色谱柱。本方法建议使用与测试方法接近的方法，例如：

检测器：示差折光检测器

溶剂：三氯甲烷（CHCl3）

温度：35℃

流速：1mL·min-1

测试溶质：约10000g·mol-1的聚苯乙烯标准品

浓度：1.0g·L-1

进样体积：20μL

对于近似高斯分布的溶质峰，式（１）可用于计算塔板数N（或由数据处理系统计算给出）：

N/L=16(V R/W)2/L (1)

式中：

N———塔板数，单位为个；

L———总柱长，单位为米（m）；

V R———峰淋洗体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min）；

W———峰底宽度，体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min），色谱峰两侧的拐点所作的切线在基线上的截距。

7.3 分离度

分离度（R）代表色谱柱的分离能力，本方法规定R s值不小于2.0。两种分子量不同且因数是10的两种聚合物标准品（分散性小于1.1）进样质量浓度不大于0.03%，进样量20μL。按照式（2）计算分离度（或由数据处理系统计算给出）：

R S=2×(V r2-V r1)/(W1+W2 ) (2)

式中：

R S——分离度，无量纲；

V r1——标准品1的峰淋洗体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min）；

V r2——标准品2的峰淋洗体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min）；

W1——标准品1的峰底宽度，体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min）；

W2——标准品2的峰底宽度，体积，单位为毫升（mL）或时间，单位为分（min）。

7.4 检测器响应

选择HPSEC操作条件和设定最优化检测器响应，使用者可参考ASTM E685第5部分和第7部分测试液相色谱检测器的性能。如果测试方法是有效的，聚合物检测峰髙或所有峰面积积分值应直接与进样聚合物质量成比例，可进样不同浓度的相同的聚苯乙烯确认。

7.5 基线稳定性

所选仪器条件应保证最小的基线噪声。噪声分为短噪声、长噪声和漂移。短噪声为频率大于1循环/分钟时检测器信号随机变异的最大峰峰振幅，不应超过2%的最大聚合物信号。长噪声为频率在0.1循环/min~1循环/min时检测器信号的所有随机变异的最大振幅，不应超过5%的最大聚合物信号。漂移为在超过1h测量噪声的平均斜率，如果漂移超过2%的最大聚合物峰信号而且没有校正可能导致错误结果。

7.6 流速

流速应定期核查。建议采用（1±0.1）mL·min-1，流速精密度应小于0.3%。当流速变化超过0.3%，更换或检修泵、加装流速监测器或使用流速内标物，如甲苯。

7.7 凝胶渗透色谱仪工作条件

使用凝胶渗透色谱仪测定样品溶液。由于测试结果取决于所使用的仪器，因此不能给出分析的通用参数，实验表明下列的条件参数是适用的。

1)检测器：示差折光检测器

2)色谱柱：采用排阻极限为7×104及1×107的凝胶渗透色谱柱串联，或符合要求的同类产品。

3)温度：35 ℃

4)溶剂：三氯甲烷

5)溶剂流速：1mL·min-1

6)进样体积：20μL

7)聚合物样品溶质浓度：2.0g·L-1~10g·L-1

7.8 校正

7.9 校正步骤

待测样品需在分析前估算分子量范围，以便选择合适的聚苯乙烯校正标准溶液。使用三氯甲烷配制聚苯乙烯校正标准系列溶液。进样量应与样品进样量一致，可根据使用柱子的直径，选择合适的进样量。

7.10 校正曲线

HPSEC的校正曲线以测量峰洗脱时间t R，对校正标准物质分子量值的对数作图，lgM w=a+bt R。在实际的HPSEC分离机制，校正曲线一般假设为S型（见图1），高于溶质A分子量的和低于溶质D分子量的是无效量。数据处理可以使用不同方法处理校正数据。