鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞的培养
鸡胚原代细胞的培养{能力目标}·了解鸡胚的发育过程。
·掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。
{实验器材}(1)Hank's液、含10%~20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。
(2)超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、吸尔球、灭菌吸管、平皿、毛吸管、离心管、剪刀、小镊子、培养箱、倒置显微镜。
{实验内容及操作步骤}一、鸡胚的孵育受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，人温箱培养。
在温箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃即可。
二、鸡胚的发育过程(1)观察方法：将9~12日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。
(2)鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。
鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。
在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。
发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。
一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。
至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。
羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。
尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。
外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。
绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。
此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。
'胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。
在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d 后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养和细胞培养
鸡胚培养和细胞培养第⼀节鸡胚接种⼀、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多⼈类和动物病毒的⽣长增殖，是常⽤的病毒分离培养⽅法之⼀（⾐原体、⽴克次体的分离亦⽤鸡胚）。
⽬前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应⽤较多。
可⽤于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再⽤鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是⼀种不可缺少的培养⼿段。
鸡胚培养的优点是，来源充⾜，价格低廉，操作简单，⽆需特殊设备或条件，易感病毒谱较⼴，对接种的病毒不产⽣抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需⽤第⼆试验系统来测定病毒存在与否；⾮ SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚⾄还可能带有鸡⽩痢沙门⽒菌、霉形体、鸡⽩⾎病等病毒。
因此，⽤鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使⽤⾮免疫蛋来孵鸡胚，最好⽤ SPF 鸡胚。
⼀般说来，孵育⾄ 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的⽣长，因为此阶段鸡胚发育⽇趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，⾻胳不健全，还未长出⽻⽑，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获⾼滴度的病毒，14 天以后，胚胎⾻骼硬化，胚⽪表⾯⽻⽑渐⽣，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）⼀定要注意到这⼀点。
孵育⾄ 21 天左右，⽺⽔和尿囊液已全部被胚胎吸收，⼀部分卵黄陷⼊胚胎腹部，另⼀部分则仍留在体外，胚胎已发育成⼩鸡，破壳⽽出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为⽯灰质的卵壳，上有⽓孔供⽓体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使⽓体分⼦与胚胎内的液体分⼦在内外进⾏交换，因此在孵育时需要有⼀定的湿度和空⽓。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱⽔、引起鸡胚死亡。
⽓流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
原代细胞培养
鸡胚原代细胞的培养[实验目的]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。
[实验材料]9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。
[实验内容及操作程序]1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素100ug/ml。
胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。
用7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。
32、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。
剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。
用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。
3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。
待液体变混而稍稠，中止消化。
4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振摇三角瓶，以使细胞分散下来。
加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。
继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。
5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。
塞好瓶塞，轻摇细胞瓶混匀。
6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。
塞紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。
4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)
13. 分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培 养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积 5ml; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 后天上午来观察细胞,并进行细胞传代. 生长面
含鸡胚鸡蛋示意图
标记气室示意图
培养中的成纤维细胞
注 意
清理台面,用品洗净,交回. 预习下节课内容：细胞的传代培养/冻存 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作, 本周的原代培养和传代培养. 要对结果进 行分析。
• B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化 接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养 器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。
• C悬浮细胞培养 某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某 种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶 段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加 适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使 用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每 毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳 定
6. 将材料转入B再次清洗; 7. A换Hank’s，材料再于A中漂洗; 8. 剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37 ℃水浴锅中 消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次; 11. 于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化. 用吸管充分吹打7~8次; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
实验二_原代细胞培养
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱl 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和 酒精消毒气室部。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每 瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上 盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min， 充分振荡后进行计数。
2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜， 穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚 放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用 无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳 糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血 清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗 液。如此重复1次。
实验二 原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞
的制备与培养方法。
A
B
A 上皮细胞 B 成纤维细胞
二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数 （N）。
实验三、鸡胚细胞的原代培养lz
操作
1. 照egg, 画气室线。 egg消毒,台面消毒; 2. 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 3. 将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。
4. 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 5. 小镊撕内膜，挑出鸡胚→ A清洗,剪去头,肝,
腿,翅等。
标记气室示意图
含鸡胚鸡蛋示意图
本次实验内容
• 鸡胚是最小的不必考虑供应问题的动物 • 安全要求低
用品器材
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 吸耳球2个、 1640培养基1瓶（方瓶） 、 Hank’s液 1瓶（圆瓶）；蛋座
2.塑料篮子内： 吸管1筒， 饭盒1只（内有胶塞、剪刀、镊子、培
不同的细胞系所需要的培养基是不同的。
（一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。
2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果 的分析。
3.易发生支原体污染
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
11. 加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹 打7~8次;
12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
13. 分别取2ml和4ml细胞悬液接种至两只培养瓶 中,补加培养液至总体积5ml;
14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 15日（星期天）下午3:00来观察细胞,并进行
第四次课_3[1].9 原代细胞培养和红血球吸附
![第四次课_3[1].9 原代细胞培养和红血球吸附](https://img.taocdn.com/s3/m/aa114f23453610661ed9f444.png)
原代培养细胞呈二倍体核型
传代期：
原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。
在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期
冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转
化
衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至
用于病毒原代培养的组织首选病毒的自然 宿主细胞。
实验材料
• • • • • 8-9日龄鸡胚 RPMI1640+5%小牛血清 D-Hanks液 0.2%胰蛋白酶 灭菌眼科剪、镊子、3cm平皿、吹打管、10ml 小烧杯、25ml细胞培养瓶，50ml三角瓶、吸 管 , 紗布
实验方法
一、鸡胚细胞的原代培养 1）消毒鸡胚卵壳，在气室一端敲破卵壳，取出鸡胚 放入灭菌的平皿内 2）用剪刀除去鸡胚的头、爪和翅，用D-Hanks液漂 洗 3次 3）用眼科剪将胚胎剪成1立方毫米大小的小块 4）剪碎的组织块内加入0.2%胰蛋白酶，倒入三角瓶 中将瓶口封好，放入37 ℃水浴消化5-10分钟，
鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附
原代培养期：
1一4周。
细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛 原代培养细胞与供体组织在形态结构和功能活动上相似性大
细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同
细胞相互依存性强，细胞独立生存性差
取材和培养材料的制备
A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培 养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及 坏死的组织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润； B. 将组织块放臵于盛有培养液的培养皿中，剪碎
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。
置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
剪去头部、翅爪及脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。
鸡胚原始生殖细胞的分离培养与转基因研究的开题报告
鸡胚原始生殖细胞的分离培养与转基因研究的开题报告开题报告：鸡胚原始生殖细胞的分离培养与转基因研究一、研究背景鸡是世界上人类重要的畜禽之一，鸡蛋的生产和养殖已成为现代畜牧业的重要组成部分。
鸡的性成熟和繁殖是兽医学和畜牧学研究的重要方向。
而鸡胚原始生殖细胞是鸟类生殖发育研究中的重要组成部分，也是鸡的性成熟和后代繁殖的关键细胞。
因此，鸡胚原始生殖细胞的分离培养和转基因研究对鸡的养殖和生产具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在通过对鸡胚原始生殖细胞的分离、培养和转基因研究，探索鸡的早期生殖发育和性细胞的形成机制，并进一步深入了解鸡的繁殖生物学，为提高鸡的生产效益和质量水平提供理论和实践基础。
三、研究内容1. 鸡胚原始生殖细胞的分离和培养方法的优化。
对已有的文献资料进行调研，了解各种鸡胚原始生殖细胞的分离培养方法，总结其优缺点，并优化建立一种简易、高效、稳定的鸡胚原始生殖细胞的分离和培养方法。
2. 鸡胚原始生殖细胞的转基因技术的研究。
通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统，探究鸡胚原始生殖细胞内特定基因的生物功能和调控机制，为研究鸡的性发育和生殖生物学提供新思路。
3. 鸡胚原始生殖细胞的功能和特性的研究。
通过研究鸡胚原始生殖细胞的增殖、分化、凋亡、染色体组成等生物学特性，探讨其在鸟类性发育和生殖发育中的作用和重要性。
四、研究方法1. 分离和培养鸡胚原始生殖细胞。
采用组织分离法和细胞培养技术，选用适宜的培养基和生长因子等添加物，建立起高效、稳定的鸡胚原始生殖细胞的体外培养方法。
2. CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统。
通过文献查阅和实验操作，学习并尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统，对鸡胚原始生殖细胞进行基因编辑和转基因操作。
3. 细胞生物学和分子生物学方法。
通过细胞增殖、分化、凋亡、染色体组成等生物学特性的检测和实验操作，探讨鸡胚原始生殖细胞的生物功能和特性。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
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鸡胚原代细胞培养
[实验材料]
9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验内容及操作程序]
1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。
置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。
剪去头部、翅爪及内脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。
静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。
如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。
6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血
细胞计数板内，在显微镜下计数。
计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。
如3～5
个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数
例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为
5(0．5mL染色液)，则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3．5×104个。
7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。
(计数时，可见到大部分细胞完整分散，3～5个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。
)
活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。
8．分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1mL，瓶口橡皮塞要塞紧。
不合适者弃去，以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。
将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。
瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养，
4h后细胞即可贴附于瓶壁，24～36h生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。
附：所需的常用培养基与试剂
1．Hank’s液配制
原液甲
NaCl 8g
KCl 2g
MgSO4·7H20 2g
MgCl2·6H20 2g
2．8％CaCl2 100mL
双蒸水加至1 000mL
先将固体成分加于800mL双蒸水中，加温到50～60℃加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1 000mL。
加氯仿2mL，摇匀后于4℃贮存。
原液乙
Na2HPO4·2H20 1.2g
KH2PO4·2H20 1.2g
葡萄糖 20g
0．4％酚红 lOOmL
双蒸水加：1 000mL
将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2mL，摇匀后于4℃贮存。
Hank"s工作液
原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸水 18份
工作液分装100mL，或500mL盐水瓶中，115~C灭菌10min，使用前以7％NaHCO3调节
pH至0 7．2～7．6。
2．0．4％酚红溶液配制
酚红 0.4g
0．1％NaOH溶液 11.28mL
将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加NaOH溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至
lOOmL量杯中，最后加双蒸水至lOOmL，摇匀后，保存于4℃冰箱内备用。
3. 0.5％乳蛋白水解物溶液配制
乳蛋白水解物 5g
Hank"s液 l 000mL
将乳蛋白水解物放入1 000mL Hank"s液中，待完全溶解后，摇匀分装于lOOmL的盐水瓶中，每瓶95mL，115℃lOmin灭菌，4℃贮存备用。
4．营养液(生长液)配制
O．5％乳蛋白水解物 95mL
犊牛血清 5mL
青霉素、链霉素 lmL
将上述溶液混合后，以7％NaHCO3适量调节pH到
7.2～7.4。
维持液按上述方法，加
犊牛血清2.5mL即成。
5．MEM培养液MEM培养基一袋，加1 000mL双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100ml盐水瓶中，每瓶90ml，用前以 7％NaHC03调pH到7.2～7.4，并加10％犊牛血
清。
6．双抗配制
青霉素 100万IU
链霉素 1g
Hank"s液 100mL
将青、链霉素溶解于：100mL Hank"s溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lmL，内含有青霉素IIU，链霉素10000μg，低温冻结保存。
使用时每100mL营养液中加双抗lmL，即每mL营养液中含青霉素100IU，链霉素
100gμg。
7. 7％ NaHCO3溶液配制
NaHCO3 7g
双蒸水 100mL
将NaHC03溶于双蒸水中，置锅中加热溶解，115℃10min灭菌后，无菌操作分装
小瓶，每瓶lmL，4℃保存。
8. 0.25％胰配制
胰蛋白 0.25g
Hang’s液 100mL
将胰溶于Hank"s液中，待完全溶解后，用0.2μm滤膜过滤，检验无菌后才能使用。
无菌分装小瓶，每瓶
5mL，低温冻结保存。
使用时，以7％NaHC03调节pH 到7.6-7.8。