体积排阻色谱
GPC与SEC的区别
GPC与SEC的区别凝胶过滤层析（GFC，gel filtration chromatography），体积排阻层析（SEC，size exclusion chromatography），凝胶渗透层析（GPC，gel permeation chromatography）尺寸排阻层析（SEC）按流动相的不同分为两类：以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透层析（GPC），以水溶液为流动相者称为凝胶过滤层析（GFC）。
凝胶色谱法的分离机制只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相的性质无关。
当然需要标准物质了啊，但是GPC/SEC/GFC和HPLC的标定还是不同的：HPLC 是通过标定来确定在某一个保留时间处所出的峰是什么物质，通俗说是什么东西、是哪种物质；而GPC/SEC则不同，标样标定的是分子量、准确说是流体力学体积的大小，与具体是何种物质无关。
HPLC用标样定性，是确定其化学性质；而GPC/SEC用标样定性，是确定其分子量、体积等物理化学性质，这一性质是数字的、连续的，因此才需要用外标曲线法，将样品峰与这一曲线结合，即可得到峰值分子量。
而且，往往是标样与样品并不是同一种化学物质，此时得到的分子量就叫做相对分子量了。
GPC和SEC有什么区别啊基本一样，GPC是按使用的填料来对分离方式称谓的（填料为凝胶），SEC是按分离机理（体积排斥）来称谓的GPC是SEC中的一种，还有GFC，GFC与GPC不同的地方就是流动性的种类一般不同，GFC和GPC都可以用来做分子量测定还是稍微有些区别的。
严格来讲：当你使用有机物作为流动相的时候，被称作凝胶渗透色谱，使用的柱子被成为Organic GPC Columns当你使用水作为流动相的时候，被成为体积排阻色谱，使用的柱子被成为Aqueous SEC Columns他们只是叫法不同而已，原理也是一样的，都是体积排阻，分子大的先出来，分子小的后出来，分子大小和需要的流动相体积有一定的关系来确定其分子量的分布。
分子排阻色谱法
测定方法
直接法：在测定淋出液浓度的同时，测定其粘 度或光散射，从而求出其分子量。 间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样 为标准样品，分别测定它们的淋出体积（保留 时间），建立保留时间与分子量二者之间的关 系，从而求出其分子量。
间接法
右中检所）
右旋糖酐分子量D1 M 2500 ； 右旋糖酐分子量D2 M 4600 ； 右旋糖酐分子量D3 M 7100； 右旋糖酐分子量D4 M 10000； 右旋糖酐分子量D5 M 21400；右旋糖酐分子量D6 M 41100 ； 右旋糖酐分子量D7 M 84400； 右旋糖酐分子量D8 M 133800； 右旋糖酐分子量D0 M 180； 右旋糖酐分子量D2000 M 2000000
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物做一条 淋洗体积或淋洗时间和相对分子量对应关系曲线，称 为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准 样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下， 做一系列的GPC标准谱图，以重均分子量的对数值 (lgM)对保留时间(t)作图，所得曲线即为“校正曲线”。 通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对 分子量与相对分子量分布的信息。
测定方法
色谱条件与系统适用性试验 TSK G PWXL柱 柱温35℃ 进样量20µl 流动相：0.71%硫酸钠溶液(内含0.02%叠氮化钠) 0.5ml/min 取葡萄糖和葡聚糖2000，分别加流动相制成10mg/ml 的溶液，进样,测得保 留时间tT和t0，对照品溶液和供试品溶液的保留时间均应在tT和t0之间，理论板 数按葡萄糖峰计算不小于5000。 对照品溶液：取右旋糖酐分子量对照品(中检所) 适量，分别加流动相制成 10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 供试品溶液： 取供试品适量，加流动相制成10mg/ml 的溶液，室温放置过夜。 测定法：取对照品溶液，进样，用GPC软件计算回归方程。取供试品溶液， 同法测定，用GPC软件算出供试品的重均分子量及分子量分布。
体积排阻色谱法
体积排阻色谱法
体积排阻色谱法是一种能够快速准确地确定化合物结构的分离技术，它利用体积排阻和色谱分离原理，以色谱梯度浓度应力为基础，从而提供对未知化合物的组成的清晰可见的识别图谱。
体积排阻色谱法的核心是以反向流间断模式实现的色谱梯度，该模式可精确控制流动状态，即流速和溶液分子量，以及建立由高到低的载体植入密度，从而最大限度控制梯度释放和定位，达到最优的分离效果。
体积排阻色谱法在各种色谱仪器上都可以实现，有利于优化分离条件，简化样品前处理。
它可以实现不受溶剂影响、无需改变温度和比重浓度的连续分离，使用低浓度化合物可以提高分离度，从而获得更好的保守性和分离性，适用于氨基酸、维生素、葡萄糖、抗生素、催化剂和其他有机物的分离。
同时，该技术还可以进行分子量、常压溶解度、可溶性和分子模型等特性分析。
因此，体积排阻色谱法可以有效地提高分子分离效率，节约装置占地面积及实验时间，减少样品使用量，是近几年分离研究的首选技术。
综上所述，体积排阻色谱法是一种先进的分离技术，它以色谱梯度浓度应力为基础，可提供准确的结构识别图谱，从而用于多种有机物的快速分离，以提高研究过程的效率和稳定性。
排阻色谱法
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定
（中小分子）有机物的定量分析
生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
（一）分子量的测定方法
凝胶柱的标定：
用一系列已知相对分子质 量M的标准品（最好与样品 化学组成相同），测定它 们在该凝胶柱上的保留体 积Ve（或保留时间），绘 制lgM-Ve曲线。
（溶胀处理平衡后重量 干燥重量） 溶胀率 100% 干燥重量
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小， 分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒 径较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
排阻色谱法
一、简
介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂 主要是水。 （二）分类： 主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量 分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝 凝胶过滤色谱法-GFC胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC）
流动相 采用水溶液或缓冲液作为流动 相
凝胶过滤色谱（GFC）
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等 交联聚苯乙烯凝胶
分子体积排阻高效液相色谱法测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物的浓度
药物分析杂志Journal of Pharmaceutical Analysis药物分析杂志 线性关系考察 精密吸取混合对照品储备液、4、6、8、10 mL ，分别置10 mL 量瓶中，用70%甲醇水溶液定容至刻度，即得系列混合对照品溶液。
分别精密吸取上述系列混合对照品溶液10 μL ，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。
以峰面积（Y ）葛根素（puerarin ） 2. 连翘酯苷A （forsythiaside A ） 3. 黄芩苷（baicalin 牛蒡苷（arctiin ）混合对照品（mixed reference substances ） B. 样品（sample ） C. 缺葛根阴性样品（negative sample of Puerariae Lobatae Radix ） D. 缺连翘阴性样negative sample of Forsythiae Fructus ） E. 缺黄芩阴性样品（negative sample of Scutellariae Radix ） F. 缺炒牛蒡子阴性样品（negative sample ofArctii Fructus ） 小儿解表颗粒HPLC 色谱图 HPLC chromatograms of Xiao ’er Jiebiao granules表2 4个成分的线性回归方程、相关系数（r ）及线性范围Tab. 2 The regression equation ，correlation coefficients and linear ranges of 4 components成分（component ）回归方程（regression equation ）r线性范围（linear range ）/（μg ·mL -1）葛根素（puerarin ）Y =45.19X +7.5460.999 9 4.799~47.99连翘酯苷A forsythiaside A ）Y =16.61X +1.3590.999 93.968~39.68黄芩苷（baicalin ）Y =32.55X +13.430.999 916.76~167.6牛蒡苷（arctiin ）Y =5.843X +0.992 80.999 97.082~70.82药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志。
体积排阻色谱 (sec)柱用的仪器
体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种常用的色谱技术，也称为凝胶过滤色谱，它基于分子在流体中的尺寸和形状的差异，从而实现对分子的分离和分析。
而在SEC技术中，柱是至关重要的部分，体积排阻色谱柱是SEC技术中使用的一种特殊类型的柱，下面将详细介绍体积排阻色谱柱用的仪器。
1. 体积排阻色谱柱的特点体积排阻色谱柱是一种工程化的柱，与常规液相色谱柱有所不同。
它具有以下特点：（1）外围设计：体积排阻色谱柱通常采用不锈钢或者玻璃材质制成，外围设计均匀、结构合理，能够有效支持柱内填料，确保填料不会受到外力破坏。
（2）填料选择：体积排阻色谱柱的填料通常是粒径均匀的多孔球形颗粒，具有一定的孔径范围，能够较好地分离分子。
（3）稳定性：体积排阻色谱柱能够在一定的操作条件下保持较好的稳定性，不易受到外界影响而发生变形或损坏。
（4）易于连接：体积排阻色谱柱通常设计成易于连接的结构，可以与其他色谱设备灵活组装，便于操作和维护。
在体积排阻色谱实验中，除了色谱柱外，还需要配备一系列的仪器，以确保实验顺利进行。
主要的仪器包括：（1）色谱系统：用于将样品注入到色谱柱中，并控制流速、温度等操作参数。
色谱系统通常包括进样器、泵、检测器等部件。
（2）检测器：用于监测样品在色谱柱中的运动轨迹并进行信号采集和处理。
常见的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等。
（3）设备连接：用于连接色谱柱和其他仪器，包括管道、接头、密封件等。
这些连接件需要具有良好的密封性能，以避免样品泄漏。
（4）温控设备：用于控制色谱柱和样品的温度，以确保实验在恒定的温度条件下进行。
在选择和使用体积排阻色谱柱时，需要注意以下几点：（1）填料选择：根据待分离的目标分子的分子量范围，选择合适的填料颗粒大小和孔径范围。
（2）流速控制：流速对于色谱分离效果至关重要，需要根据实验要求合理设置流速。
GPC系统介绍和谱图解析
0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 Minutes
山东圣泉化工股份有限公司 2007年10月
1.凝胶色谱概述
• 凝胶色谱法（GPC）又称之为体积排阻色谱法 （SEC）。它是液相色谱中的一种，但与其他液 相色谱的分离机理不同，是基于试样分子的尺寸 和形状不同来实现分离的。
• 凝胶色谱技术是上世纪末发展起来的一种快速而 又简单的分离分析技术，由于其对高分子 物质有 很高的分离效果。目前已经在高分子化学、分子 生物学、医学等有关领域的科学实验研究和工业 生产得到广泛采用。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可以进入凝胶颗粒的微孔中即进入凝胶相内在向前移动的过程中从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒如此不断地进入和扩散小分子物质的前进速度落后于大分子物质从而使样品中分子大的先流出色谱柱中等分子的后流出分子最小的最后流出得到了最终的凝胶色谱图
凝胶色谱系统介绍和谱图解析
部分添加剂的定量，这大 大提高了凝胶色谱在酚醛 树脂分析中的定性定量能 力。
0.40
• 相同物质在不同波长下色
0.ห้องสมุดไป่ตู้0
谱图明显不同
0.20
• 左图为PF-1350分子量和
0.10
水杨酸在不同波长下的检
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes
赛分科技-SRT体积排阻色谱柱
体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱—水溶性体积排阻色谱柱水溶性体积排阻色谱柱概述SRT 、Zenix 、SRT-C 和Zenix-C 系列体积排阻色谱柱均采用经特殊表面修饰的高纯硅胶作为填料，其修饰方式为在硅胶表面化学键合一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。
SRT 、Zenix 和SRT-C 、Zenix-C 键合方式的不同之处在于：前两者固定相表面键合的是一层“站立”着的单分子层，而后两者则是一层“平躺”着的单分子层。
同时Zenix 和Zenix-C 为3 um 粒径，SRT 和SRT-C 为5 um 粒径，这四款体积排阻柱相互配合，可满足客户对分辨率及柱效的不同要求。
赛分科技完整的产品线为生物分子体积排阻分离提供了稳定、重现和最高分辨率的最优选择。
固定相的差异图1. 固定相修饰的差异：SRT 和Zenix 在硅胶表面修饰了一层“站立”着的亲水中性单分子层，SRT-C 和Zenix-C 在硅胶表面修饰了一层“平躺”的亲水中性单分子层。
粒径差异图2. Zenix 和Zenix-C 以3 µm 多孔硅胶为基质； SRT 和 SRT-C 以5 µm多孔硅胶为基质Zenix 和Zenix-C 的独特优点Zenix 和Zenix-C 色谱柱采用3 µm 粒径的填料，为生物分子的分离提供最高的柱效。
表1. Sepax SEC 色谱柱的主要特点SRT体积排阻色谱柱SRT SEC键合固定相采用专利的表面修饰技术，通过在高纯度具有良好机械稳定性的硅胶基质上，键合一层均匀的纳米厚度中性亲水薄膜而制备得到。
工艺采用可控的化学修饰技术，因此能确保柱与柱之间有着可靠的重现性。
SEC填料采用化学键合技术，表面亲水涂层覆盖完全，因此不仅具有优异的稳定性，而且对蛋白等生物样品的非特异性吸附作用也非常小。
精心设计的大孔体积可保证高的分离容量以及优异的分辨率。
广泛应用于生物分子及水溶性聚合物的分离和检测。
体积排阻色谱_(sec)柱用的仪器_概述说明以及解释
体积排阻色谱(sec)柱用的仪器概述说明以及解释1. 引言1.1 概述体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种常用的分离和测定高聚物、生物大分子以及纳米材料的方法。
它基于溶剂流动时样品在柱填充物中的渗透性，通过这种渗透性差异来实现对不同大小分子的分离。
SEC在生命科学、化工、材料科学等领域具有广泛的应用前景。
本文旨在对体积排阻色谱所使用的仪器进行概述说明，并解释其工作原理和关键组件。
同时，我们将介绍体积排阻色谱柱的结构、选择和优化方法，以及对样品准备、流动相选择和优化、参数设置和调整等方面给出操作注意事项。
1.2 文章结构本文包括引言、体积排阻色谱(SEC)柱介绍、体积排阻色谱仪器装置及关键组件说明、体积排阻色谱分析方法和操作注意事项以及结论部分。
在引言中，我们将对文章内容进行概述说明，并明确文章结构。
接下来，我们将详细介绍SEC柱的原理、结构以及选择和优化方法。
然后，我们将对体积排阻色谱仪器装置中的压力控制系统、流速控制系统和柱温控制系统进行说明。
在接下来的部分，我们将介绍体积排阻色谱分析方法所涉及的样品准备与预处理要点、流动相选择和优化方法以及参数设置和调整技巧。
最后，我们通过结论对整篇文章进行总结。
1.3 目的本文的目标是全面介绍体积排阻色谱所使用的仪器，帮助读者了解仪器的工作原理和关键组件，并提供一些操作须知。
通过阅读本文，读者将对体积排阻色谱有更深入的了解，并能够在实验中正确选择和使用相关设备，从而更好地开展SEC 柱分析工作。
2. 体积排阻色谱(SEC)柱介绍:2.1 SEC柱原理:体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种基于分子尺寸差异的色谱技术。
该技术利用特殊设计的SEC柱实现对溶液中分子的分离和纯化。
其原理是根据样品中溶质分子在柱填料孔隙中的扩散速度而进行分离。
大尺寸分子由于无法进入较小的孔隙而沿柱床快速流过，而小尺寸的分子则能进入较小孔隙并在其中被滞留更长时间，因此产生了不同尺寸分子之间的强迫排阻现象。
8-4 液相色谱之体积排阻色谱
体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。
SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。
尺寸排阻色谱法原理
尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。
在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。
定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。
分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
体积排阻色谱 (sec)柱用的仪器
体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）是一种分离技术，通过固定在柱内的多孔分子筛来分离溶液中的大分子和小分子。
SEC技术在生物化学、药物研究和生物医学领域中得到广泛应用，因此对SEC柱用的仪器也要求越来越高。
SEC柱用的仪器主要包括色谱柱、色谱柱箱、流动相系统、检测器和数据处理系统等部分。
色谱柱是SEC技术的核心组成部分，它通过分子筛效应来分离目标分子。
色谱柱的选型会直接影响到分离效率和分辨率，因此选择合适的色谱柱对于SEC柱用的仪器至关重要。
常见的色谱柱材质有硅胶、聚碳酸酯、聚乙烯醇等，不同的材质适用于不同的分析范围和分子量范围。
色谱柱箱是SEC柱用的仪器中的另一个重要组成部分，它负责将溶液以流动相的形式送入色谱柱，并确保色谱柱稳定地运行。
色谱柱箱通常需要具备一定的自动化功能，如流速控制、温度控制和压力控制等，以确保分析的精确度和重复性。
一些先进的色谱柱箱还具备多柱并联的功能，可以同时进行多种样品的分析，提高实验效率。
流动相系统是SEC柱用的仪器中的另一个关键部分，它负责将溶液从样品进样口送入色谱柱中，以进行分析。
流动相系统通常需要具备高精度的流速控制功能，以确保色谱柱内的流速稳定，并通过机械泵、梯度泵等方式来实现不同流速的控制。
一些先进的流动相系统还具备多通道进样功能，可以同时进行多个样品的分析，提高实验的效率。
检测器是SEC柱用的仪器中的另一个重要组成部分，它负责检测色谱柱中流出的溶液成分，并将检测到的信号转化为电信号输出。
常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等，不同的检测器适用于不同的分析目标。
在SEC技术中，光散射检测器特别适用于大分子的分析，因为它可以直接测定分子的分子量分布和聚集度等参数。
数据处理系统是SEC柱用的仪器中的最后一个重要组成部分，它负责对检测器输出的信号进行数据处理和分析，并对结果进行显示和记录。
GPC基础知识
间接方法
– GPC (for Mn, Mw and Mz) 用标准品进样得到分子量校正曲线， 用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出 聚合物样品的相对分子量。 聚合物样品的相对分子量。如和标准品结构不 同，还需进行相应的计算才能得到聚合物样品 自身的分子质量
相对分子量分布(多分散性指数 对聚合物的性质 相对分子量分布 多分散性指数)对聚合物的性质 多分散性指数 有重要影响。 有重要影响。 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们 在相对分子质量分布（多分散性指数） 关注的热点后， 关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物 的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应 的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱 的应 用改善了测试条件， 用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合 物的相对分子质量及其分布的方法， 物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测 定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和 定高分子相对分子质量及其分布最常用、 有效的技术。 有效的技术。
15.0 16.0 17.0 18.0 4.0 5.0 log(M.W.) 6.0 1 5.5 2 3 4 5 4.5 6 7 8 min
常用线性拟合或者三次方拟合
GPC校正方法
窄分布标样校正法
– 选用与被测样品同类型的单分散性 选用与被测样品同类型的单分散性(d≤1.1)标样，先用 标样， 标样 其他方法精确测定其平均相对分子质量， 其他方法精确测定其平均相对分子质量，然后与被测 样品在同样的条件下进行GPC分析。 分析。 样品在同样的条件下进行 分析
第二章：体积排阻色谱(GPC)与光散射技术 SEC-MALS
9
SEC - MALS 测定法几点建议
• 对于水相体系，建议使用0.1 µm 对流动相过滤；而对于有机相 体系，建议使用0.2 µm 对流动相过滤；
• 使用在线脱气装置（In-line degasser）； • 添加在线过滤器（ In-line membrane filter ）：
水相体系：PEEK 材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器；
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
17
数据分析 – Peaks
UV, RI LS
• 单分散性高分子：选峰范围对结果影响很小。 • 多分散性高分子：选峰范围对结果影响较大。
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基于高分子分子尺寸大小不同而分离的色谱法。（分子尺寸大小： hydrodynamic volume.）
• MALS = Multi-Angle Light Scattering（多角度光散射）
• SEC-MALS: 多角度光散射与体积排阻法联用技术
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• 逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速；
* 以上建议有助于延长泵、柱子的寿命（即使不使用光散射仪）。
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10
摩尔质量 - 定义
Number average molar mass: Weight average molar mass:
体积排阻色谱和蛋白分离纯化
体积排阻色谱和蛋白分离纯化在生物科学领域，蛋白质的分离纯化是至关重要的研究环节。
体积排阻色谱法作为一种常用的蛋白质分离技术，具有广泛的应用前景。
本文将深入探讨体积排阻色谱法的原理、应用以及面临的挑战。
一、体积排阻色谱法的原理体积排阻色谱法，也称为凝胶过滤色谱法，其基本原理是利用固定相的孔径大小对样品进行分离。
在色谱柱中，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒的内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。
随着流动相的流动，大分子蛋白质将比小分子蛋白质更早地流出色谱柱，从而实现样品的分离。
二、体积排阻色谱法的应用体积排阻色谱法在蛋白质分离纯化中具有广泛的应用。
首先，该方法可以用于分离和纯化各种生物分子，如蛋白质、多糖和核酸等。
其次，体积排阻色谱法可以用于蛋白质的分子量测定和分子量分布研究。
此外，该方法还可以用于蛋白质的脱盐、脱水和脱磷等预处理过程。
三、面临的挑战尽管体积排阻色谱法在蛋白质分离纯化中具有广泛的应用，但仍面临一些挑战。
首先，对于一些具有相似分子量或性质的蛋白质，分离效果可能不佳。
其次，对于一些具有较大分子量的蛋白质，可能会在凝胶颗粒内部形成聚集物，影响分离效果。
此外，对于一些具有不稳定性质的蛋白质，可能会在色谱柱中发生变性或降解。
四、未来展望为了克服体积排阻色谱法面临的挑战，未来的研究可以关注以下几个方面。
首先，开发新型的固定相材料，以提高对相似分子量或性质的蛋白质的分离效果。
其次，优化色谱柱的制备工艺，以提高对大分子量蛋白质的分离效果。
此外，研究蛋白质在色谱柱中的行为，以了解其变性和降解机制，为提高蛋白质的稳定性提供理论支持。
总之，体积排阻色谱法作为一种常用的蛋白质分离技术，具有广泛的应用前景。
尽管面临一些挑战，但通过不断的研究和改进，相信该方法在未来的蛋白质分离纯化中将发挥更加重要的作用。
排阻色谱法
一、分离原理排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。
是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。
色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。
凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。
仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。
对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。
小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。
因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。
因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。
将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。
如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。
很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。
随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。
将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。
如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。
凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。
同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。
可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。
GPC
– 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯 共聚物
高聚物的性能特别是机械性能、加工性
能及高分子在溶液中的特性等都与高聚物分 子量有关。如冲击强度、模量、拉伸强度、 耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分 子量分布有关(分子量低易碎，分子量高难加工)。例 如，一般的聚苯乙烯制品平均分子量为十几 万，如果分子量低到几千极易粉碎，几乎没 有应用价值。当分子量达到20万以上时，其 机械性能较好，但分子量达到百万以上时， 又难以加工，也失去实用价值。
一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在 0.05~0.5%（质量分数）范围内配置。分子质量越 大，溶液浓度越低。
标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室 温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超 声或者剧烈振荡来加速溶解。
溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入 色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。
2 17.0
3
4 5
6 7
8
18.0
19.0
20.0
21.0 min
mV(x10) Detector B
1.0
样品分析结果
17.723
0.0
-1.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
Mn
Mw
Mz
Mz1
Mw/Mn Mz/Mw
43679 73178 101377 125121 1.67534 1.38536
结果评价示例
PS1和PS2为同一操作人员测定同一样品的两次测定结果 PS3为另一实验室对同一样品测得的结果
例
体积排阻色谱 准确度 验证
体积排阻色谱准确度验证
体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种分离和分析高分子化合物的方法，通过分子在固定填料中的渗透来实现。
在使用SEC进行准确度验证时，需要考虑以下几个方面：
1. 样品准备，在进行SEC分析之前，需要对样品进行适当的准备工作，包括溶解、过滤等步骤，以确保样品的稳定性和一致性。
2. 校准曲线，为了确保SEC分析的准确性，通常需要建立标准曲线，通过一系列已知分子量的标准物质进行SEC分析，并建立分子量与保留时间的关系，以便后续对未知样品的分子量进行准确测定。
3. 仪器校准，对SEC分析仪器进行定期的校准和验证是确保准确性的关键步骤，包括流速的校准、检测器的灵敏度校准等。
4. 数据分析，在进行SEC分析后，需要对得到的数据进行准确的分析和处理，确保结果的可靠性和准确性。
5. 方法验证，最后，对SEC分析方法进行验证，包括重复性、
精密度、线性范围等方面的验证，以确保该方法在不同条件下的准确性和可靠性。
综上所述，对体积排阻色谱进行准确度验证需要从样品准备、校准曲线、仪器校准、数据分析和方法验证等多个方面进行全面考虑，以确保SEC分析结果的准确性和可靠性。
单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发-Waters
pH 6.0
0.24
USP分离度 = 1.3
0.22
聚集体 = 5.3%
0.20
0.18
pH 6.8
0.16
USP分离度 = 1.3
0.14
聚集体 = 5.7%
0.12
pH 7.6
0.10
USP分离度 = 1.1
0.08
聚集体 = 5.3%
0.06
0.04
0.02
0.00
方法条件 LC条件： 系统：
波长： 色谱柱：
柱温： 样品温度： 进样体积： 流速： 流动相： 最终组成：
数据管理 软件：
配备TUV和钛合金流通池 的ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统
214和280 nm
ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm, 4.6 x 150 mm, 部件号186005225
为了展示这些影响，我们在4.6 x 150 mm以及4.6 x 300 mm的色谱柱上运行了一组蛋白标准品。 校准曲线的对比结果显示，与150 mm色谱柱相比，300 mm色谱柱的校准曲线斜率更加平缓， 说明增加色谱柱长度可增强其分离能力(图6)。
150 mm
蛋白质
分子量
6.5
300 mm
甲状腺球蛋白 670000
除了蛋白质标准品外，我们还评估了溶于50-250 mM氯化钠中的小鼠单克隆抗体(mAb) 的SEC分离情况(图2)。正如通常会在凝胶过滤填料上观察到的一样2，较大的离子强度 可减少mAb单体的峰拖尾现象并使峰形更窄。当氯化钠浓度从50升至200 mM时，mAb的 峰高从0.189升至0.289。USP拖尾因子也从1.64降至1.22。而当流动相离子强度从200升 至250 mM氯化钠时，上述变化不再明显(USP拖尾因子 = 1.20)。
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一. 分离原理
尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。
排阻色谱的固定相多为凝胶。
凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。
凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。
尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。
尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。
因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。
小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。
经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。
当组分X进
入色谱固定相达到扩散平衡时：
Xm ⇌ Xn
组分的分配系数为：
尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1
二. 固定相
尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。
无机凝胶：又称硬质凝胶。
是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装
紧，柱效较低。
有机凝胶：又称半硬质凝胶。
如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。
但在有机溶剂中有轻度膨胀。
新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于
生物大分子的分离。
三. 流动相
尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶
过滤色谱)等。
(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。