酶联免疫吸附试验.ppt
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免疫实验 酶联免疫吸附试验
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
显色原理
DH2 + H2O2
HRP
（底物）
D + 2H2O
常用的供氢体：
邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS
免疫学实验课
酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法)
实验内容
一、酶联免疫吸附试验(ELISA) 直接法-测酶标抗体的效价
二、免疫标记技术的基本原理、类型 及应用
实验目的
掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。
实验原理示意图
包被抗原
实验材料
试剂：
封闭液
6ml
第1列：阴性对照（Ag-/Ab+）第2列：阴性对照（Ag+/Ab-） 第10列：空白对照（Ag-/Ab-）
包被
固相支持物： 聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特 性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合）
包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液（pH＝9.6） 磷酸盐缓冲液（pH＝7.2） Tris-HCL缓冲液（pH＝7-8）
Blocking E E
EE
Without blocking
最常用的封闭剂：
0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶
洗 液（PBS-T）
磷酸盐缓冲液：（PBS） 吐温20（Tween 20):
非离子型表面活性剂 抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面
标记抗体常用的酶
吸水纸
若干
记号笔
1支
显色原理
DH2 + H2O2
HRP
（底物）
D + 2H2O
常用的供氢体：
邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS
免疫学实验课
酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法)
实验内容
一、酶联免疫吸附试验(ELISA) 直接法-测酶标抗体的效价
二、免疫标记技术的基本原理、类型 及应用
实验目的
掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。
实验原理示意图
包被抗原
实验材料
试剂：
封闭液
6ml
第1列：阴性对照（Ag-/Ab+）第2列：阴性对照（Ag+/Ab-） 第10列：空白对照（Ag-/Ab-）
包被
固相支持物： 聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特 性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合）
包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液（pH＝9.6） 磷酸盐缓冲液（pH＝7.2） Tris-HCL缓冲液（pH＝7-8）
Blocking E E
EE
Without blocking
最常用的封闭剂：
0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶
洗 液（PBS-T）
磷酸盐缓冲液：（PBS） 吐温20（Tween 20):
非离子型表面活性剂 抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面
标记抗体常用的酶
吸水纸
若干
记号笔
1支
elisa检测技术 ppt课件 共25页
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
xiexie!
ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物：
1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条件下变为
谢谢！
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ELISA试剂盒的组成
完整的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。
酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
4. 原理（以间接ELISA为例）：
显色
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
实验材料
猪瘟病毒（CSFV） —— 抗原 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB ，底物缓冲液，30% H2O2 酶标板，酶标仪
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)
1.定义
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连
（3）双抗体夹心法测定抗原
A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体;
E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
（4）竞争法测定抗原
A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次在干净吸水纸上 拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。 5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
2 核对仪器
确保酶标仪正常运行， 并进行校准和调试。
3 设定样品量
根据实验要求和预期结 果，设定合适的样品量。
ELISA操作流程
取样品
使用移液管准确地取出待测样品，并转移至反 应孔板中。
混合试剂
根据实验要求，将不同试剂混合，并加入反应 孔板中。
洗涤反应孔板
使用洗涤缓冲液彻底洗涤反应孔板，去除非特 异性结合物。
3
反应孔板处理
处理反应孔板，包括洗涤、封闭非特异性结合位点等步骤。
4
标准曲线绘制
通过稀释标准品制备标准曲线，用于分析待测样品的浓度。
材料清单
反应孔板
96孔黑胶板
用于测定光学密度
洗涤缓冲液
用于洗涤反应孔板
实验前准备工作
1 检查试剂
确认试剂溶液的保存状 态和有效期限，避免使 用过期或变质的试剂。
添加底物溶液
加入致色底物溶液，观察反应孔板颜色的变化。
实验注意事项
避光操作
在取样、反应和测量过程中， 避免试剂暴露在强光下，以 保证测量结果的准确性。
注意交叉污染
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，避免不同试剂之间的交 叉污染。
标准曲线绘制
密切按照标准曲线绘制的要 求进行操作，以获得准确的 样品浓度。
结果分析
如何避免交叉污染？
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，并避免将试剂污染到外 部容器或工作台。
应该如何解读ELISA 实验结果？
根据标准曲线将光学密度值 转化为样品浓度，并根据浓 度结果判断样品中目标物质 的含量。
1 测量光学密度
使用酶标仪测量各反应孔板的光学密度，并记录数据。
2 标准品对照
根据标准曲线将测得的光学密度值转化为待测样品的浓度。
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶联免疫吸附试验 PPT课件
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件
6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。
酶联免疫吸附试验
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
加入底 物溶液A、
B
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
▲ （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先 预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应 详细阅读说明书。
▲ （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入 比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测 定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏 感波长下的吸光度值的差值。
• 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的 非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
• 例三：饲、料酶中联黄曲免霉疫毒吸素附B1的试检验测（：ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌 的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产 物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人 造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合 起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原 抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性 高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录 和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测 、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
吸光度 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
加样(标准
样品、标 准品以及 试剂准备
品/样品， 酶标试剂
）
孵育， 洗板
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程
• ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
• （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃ ，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪 性能不同，使用前应详细阅读说明书。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
目录
酶联免疫吸附试验（ELISA）概述 • 一、 酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景 • 二、 酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程 • 三、 全自动酶免工作站 • 四、
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生
测定对象：可以是抗原也可以是抗体。
1、二食、品、酶饲联料：免疫吸附试验（ELISA）应用场景
农药残留（有机磷农药、氨基甲酸酯类农药）、兽药残留（青霉素、氯霉素 、庆大霉素等）、添加剂（三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石绿等）、真菌毒素检测（ 黄曲霉毒素、赤霉烯酮、呕吐毒素等）、微生物检测（如金黄色葡萄球菌菌体细 胞中的蛋白A等），等等；
• （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将 板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
• （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或 所用滤光片是否正确。
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
• 单波长或双波长比色选择的问题：
• 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm或492nm进行比色测定；
加入底 物溶液A
、B
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
Or
结果分 析
光密度 （OD） 测量
37℃
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
2、医疗卫生：
检验科、肿瘤科、妇科、儿科、疾控中心、传染病医院、体检中心、肿瘤医 院等（乙肝两对半、甲（丙、丁、戊）型肝炎抗体、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性 激素六项等）。
3、畜牧行业：猪口蹄疫、猪蓝耳病、禽流感H5N1抗体、鸡传染性贫血；
• 试三验流、程酶：联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
• 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗原或抗体的酶标记。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
一、酶酶结联合物免与疫相吸应抗附原试或验抗（体结EL合IS后A，）可概根述据加入底物的颜色反
应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中 相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的 颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原 的浓度。
• 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的 非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
• 例三：饲、料酶中联黄曲免霉疫毒吸素附B1的试检验测（：ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌 的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产 物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人 造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合 起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原 抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性 高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录 和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测 、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
吸光度 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
加样(标准
样品、标 准品以及 试剂准备
品/样品， 酶标试剂
）
孵育， 洗板
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程
• ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
• （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃ ，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪 性能不同，使用前应详细阅读说明书。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
目录
酶联免疫吸附试验（ELISA）概述 • 一、 酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景 • 二、 酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程 • 三、 全自动酶免工作站 • 四、
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生
测定对象：可以是抗原也可以是抗体。
1、二食、品、酶饲联料：免疫吸附试验（ELISA）应用场景
农药残留（有机磷农药、氨基甲酸酯类农药）、兽药残留（青霉素、氯霉素 、庆大霉素等）、添加剂（三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石绿等）、真菌毒素检测（ 黄曲霉毒素、赤霉烯酮、呕吐毒素等）、微生物检测（如金黄色葡萄球菌菌体细 胞中的蛋白A等），等等；
• （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将 板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
• （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或 所用滤光片是否正确。
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
• 单波长或双波长比色选择的问题：
• 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm或492nm进行比色测定；
加入底 物溶液A
、B
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
Or
结果分 析
光密度 （OD） 测量
37℃
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
2、医疗卫生：
检验科、肿瘤科、妇科、儿科、疾控中心、传染病医院、体检中心、肿瘤医 院等（乙肝两对半、甲（丙、丁、戊）型肝炎抗体、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性 激素六项等）。
3、畜牧行业：猪口蹄疫、猪蓝耳病、禽流感H5N1抗体、鸡传染性贫血；
• 试三验流、程酶：联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
• 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗原或抗体的酶标记。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
一、酶酶结联合物免与疫相吸应抗附原试或验抗（体结EL合IS后A，）可概根述据加入底物的颜色反
应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中 相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的 颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原 的浓度。