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酶联免疫吸附试验（ELISA）
目录
酶联免疫吸附试验（ELISA）概述 • 一、 酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景 • 二、 酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程 • 三、 全自动酶免工作站 • 四、
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生
免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌 的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产 物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示
吸光度 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测
天平
粉碎机
电动振荡器 移液器
离心机
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
加样(标准
样品、标 准品以及 试剂准备
品/样品， 酶标试剂
）
孵育， 洗板
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
• 例三：饲、料酶中联黄曲免霉疫毒吸素附B1的试检验测（：ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
• 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测 定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏 感波长下的吸光度值的差值。
• 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的 非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
2、医疗卫生：
检验科、肿瘤科、妇科、儿科、疾控中心、传染病医院、体检中心、肿瘤医 院等（乙肝两对半、甲（丙、丁、戊）型肝炎抗体、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性 激素六项等）。
3、畜牧行业：猪口蹄疫、猪蓝耳病、禽流感H5N1抗体、鸡传染性贫血；
• 试三验流、程酶：联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人 造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合 起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原 抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性 高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录 和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测 、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程
• ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
• （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃ ，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪 性能不同，使用前应详细阅读说明书。
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
加入底 物溶液A
、B
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
Or
结果分 析
光密度 （OD） 测量
37℃
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
• （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将 板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
• （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或 所用滤光片是否正确。
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三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
• 单波长或双波长比色选择的问题：
• 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm或492nm进行比色测定；
• 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗原或抗体的酶标记。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
一、酶酶结联合物免与疫相吸应抗附原试或验抗（体结EL合IS后A，）可概根述据加入底物的颜色反
应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中 相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的 颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原 的浓度。
测定对象：可以是抗原也可以是抗体。
1、二食、品、酶饲联料：免疫吸附试验（ELISA）应用场景
农药残留（有机磷农药、氨基甲酸酯类农药）、兽药残留（青霉素、氯霉素 、庆大霉素等）、添加剂（三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石绿等）、真菌毒素检测（ 黄曲霉毒素、赤霉烯酮、呕吐毒素等）、微生物检测（如金黄色葡萄球菌菌体细 胞中的蛋白A等），等等；
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酶联免疫吸附试验（ELISA）概述 • 一、 酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景 • 二、 酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程 • 三、 全自动酶免工作站 • 四、
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生
免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌 的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产 物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示
吸光度 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测
天平
粉碎机
电动振荡器 移液器
离心机
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
加样(标准
样品、标 准品以及 试剂准备
品/样品， 酶标试剂
）
孵育， 洗板
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
• 例三：饲、料酶中联黄曲免霉疫毒吸素附B1的试检验测（：ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
• 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测 定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏 感波长下的吸光度值的差值。
• 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的 非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
2、医疗卫生：
检验科、肿瘤科、妇科、儿科、疾控中心、传染病医院、体检中心、肿瘤医 院等（乙肝两对半、甲（丙、丁、戊）型肝炎抗体、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性 激素六项等）。
3、畜牧行业：猪口蹄疫、猪蓝耳病、禽流感H5N1抗体、鸡传染性贫血；
• 试三验流、程酶：联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人 造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合 起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原 抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性 高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录 和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测 、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流 程
• ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
• （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃ ，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪 性能不同，使用前应详细阅读说明书。
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
结果分 析
加入底 物溶液A
、B
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂
）
孵育， 洗板
Or
结果分 析
光密度 （OD） 测量
37℃
加入底 物溶液A
、B
孵育
加入终 止液
• 饲三料中、黄酶曲联霉毒免素疫B1吸的附检测试：验（ELISA）操作流程
• （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将 板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
• （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或 所用滤光片是否正确。
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三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
• 单波长或双波长比色选择的问题：
• 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm或492nm进行比色测定；
• 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗原或抗体的酶标记。
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
一、酶酶结联合物免与疫相吸应抗附原试或验抗（体结EL合IS后A，）可概根述据加入底物的颜色反
应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中 相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的 颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原 的浓度。
测定对象：可以是抗原也可以是抗体。
1、二食、品、酶饲联料：免疫吸附试验（ELISA）应用场景
农药残留（有机磷农药、氨基甲酸酯类农药）、兽药残留（青霉素、氯霉素 、庆大霉素等）、添加剂（三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石绿等）、真菌毒素检测（ 黄曲霉毒素、赤霉烯酮、呕吐毒素等）、微生物检测（如金黄色葡萄球菌菌体细 胞中的蛋白A等），等等；