分子荧光分析法
分子荧光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
分子荧光法测定实验报告
一、实验目的1. 熟悉分子荧光法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握荧光光谱仪的使用方法。
3. 通过实验，测定罗丹明B的荧光光谱，分析其激发光谱和发射光谱。
4. 掌握荧光定量分析的方法。
二、实验原理分子荧光法是一种灵敏的定量分析方法，基于物质在特定波长范围内吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态，再回到基态时释放出一定波长的荧光。
罗丹明B作为一种荧光物质，在特定波长范围内具有明显的荧光特性。
通过测定罗丹明B的激发光谱和发射光谱，可以确定其最佳激发波长和发射波长，从而进行定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、无水乙醇、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：准确移取一定量的罗丹明B标准溶液，用无水乙醇稀释至100mL，配制成一定浓度的罗丹明B标准溶液。
2. 测定激发光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，扫描激发光谱，记录激发波长范围内荧光强度的变化。
3. 测定发射光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，以激发光谱中最大激发波长为激发波长，扫描发射光谱，记录发射波长范围内荧光强度的变化。
4. 荧光定量分析：取一定量的罗丹明B样品溶液，按照上述步骤测定其激发光谱和发射光谱，计算样品溶液中罗丹明B的浓度。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择540nm作为激发波长。
2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择590nm作为发射波长。
3. 荧光定量分析：根据罗丹明B的激发光谱和发射光谱，以及标准曲线，计算样品溶液中罗丹明B的浓度为1.2×10^-5 mol/L。
分子荧光分析法
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
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32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
分子荧光分析法实验
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
10-6 ~ 10-2 s
F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光 强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若 固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发 光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的 曲线，称为激发光谱。
1.2 荧光光谱
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架 内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零 时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
7.未知试样的测定：
将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标 准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
定性分析：φf；λex；λem；峰形等
其它（略）
分子相互作用研究；
显微成像（物理迁移与化学衍化的原位 “显迹”）
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C 高端生化研究： 代谢动力学跟踪；
分子荧光分析法
分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
分子荧光的定性分析原理
分子荧光的定性分析原理
分子荧光定性分析是一种用于确定化合物是否具有荧光性质的方法。
荧光是指分子吸收光能后发出的短波长光。
以下是分子荧光定性分析的原理：
1. 激发：荧光分析通常需要先将化合物激发到一个能级，使其能够吸收能量。
通常使用紫外光或可见光来激发化合物。
这个能级通常对应着化合物的电子跃迁。
2. 吸收：化合物吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态能级。
这个激发态能级通常是一个高能量、不稳定的能级。
3. 跃迁：电子在激发态能级上停留的时间很短，随后会再次跃迁到较低的能级。
在这个过程中，荧光光子被释放出来。
光子的能量通常比激发光的能量低，对应着较长波长的光。
4. 发射：荧光光子的发射可以通过荧光光谱来观察。
荧光光谱通常是一个峰状曲线，波峰对应着荧光发射的波长。
通过比较样品的荧光光谱与已知荧光性化合物的光谱，可以确定样品是否具有荧光性质。
5. 荧光颜色：荧光发射的波长与化合物的结构密切相关，不同化合物具有不同的荧光颜色。
因此，荧光颜色也可以用来进行分子荧光定性分析。
需要注意的是，分子荧光定性分析只能确定一个化合物是荧光性还是非荧光性，
并不能提供关于分子结构和化合物量的定量信息。
为了进行准确的分子荧光定性分析，通常需要使用荧光光谱仪或相关的仪器。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
第七章-分子荧光法
第七章分子荧光分析法第一节概述物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。
物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。
根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。
荧光分析法历史悠久。
早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。
直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes 位移定律和荧光猝灭现象。
到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。
近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。
目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。
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1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性；
1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组
份混合物分析；
1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药 残留量分析。
67
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
瑞利峰 拉曼峰
31
第三节荧光分析仪器
instrument of fluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型
32
I0
It
F
33
一、仪器的主要部件 激发光源(light source)
样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)
发射 单色器
检测器 数据处理 仪器控制
45
二、仪器类型
1. 荧光光度计(fluorometer)
2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer)
46
荧光光度计 光源 溴钨灯、汞灯
荧光分光光度计 氙灯
单色器
光谱 应用
滤光片、棱镜
荧光光谱 定量分析
光栅
激发光谱、荧光光谱 定量、定性分析
47
58
（五）生命科学中
59
1. 探测和分析蛋白质的分子结构
60
2. 基因检测-分子信标
61
3. 细胞生物学中的应用
62
4.膜融合机理的研究
63
三、荧光光度计的发展
1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三 阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化
64
1. 分辨率提高：5.2μs～1ps,分辨率达±0.5ps. 2.扫描速度加快： 30000nm/min 3.多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测
对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，
F k' c
28
五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure
1.溶剂的影响
2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭
NH3 NH2 NH
OH H
OH H
27
由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程 度及荧光效率成正比，即：
F kΦ I 0 (1 10
kΦ I 0 (1 e
F ΦI a I a I 0 I I 0 (1 10
abc
abc
)
)
)
2.3 abc
当abc≤0.05（即溶液很稀）时，
F 2.3kΦ I 0 abc
发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)
7
特点 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 2～4个 数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便
8
第二节基本原理
一、分子荧光产生过程
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光物质的分子结构
四、荧光强度与溶液浓度的关系
五、影响荧光强度的外部因素
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且 荧光光谱红移。
H
H C C H
C
C
H
强荧光
无荧光
23
（3）刚性平面结构
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它 溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。
24
25
(4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度
苯
苯酚
OH
10
12
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
S1
energy fluorescence absorption external conversion
T2 T1
phsophorescence
54
（二）药物（中药）
1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚
2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱
λem=(385±1)nm，λex=301nm或激发光谱
λex：(328±1)nm，λem：425nm
55
（三）无机元素
1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素
在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液
缺点：应用范围小。
50
一、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，
因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。
定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标
准品对照，看是否一致。
51
二、定量分析 F－F0
1.标准曲线法：
Fx －F0
cx
c
52
2. 直接比较法
如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好， 可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和
18
NH2
苯胺
苯甲酸 硝基苯
20
3 0
COOH
NO2Leabharlann 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。 吸电子基团：如–COOH, 减弱甚至熄灭荧光。
C O , –NO2, –NO等，
26
四、 荧光强度与溶液浓度的关系 根据Lambert-Beer定律：
所以，
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
29
造成荧光熄灭的原因： （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭：
（4）荧光物质的自熄灭：
（5）内滤光作用和自吸现象
30
5.散射光（scattering light）
（1）瑞利（Reyleigh）散射光
（2）拉曼（Raman）散射光
怎样检测样品中的核黄 素（维生素B2） ？
核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末
饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。
1
molecular fluorescence analysis
郭建丽
卫生化学教研室
2
第一节概述
荧光的发现
植物愈创木切片黄色 水溶液 ——天兰色荧光；
3
荧光的发现
4
5
49
第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application
特点：
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：0.1～0.1g/cm-3
相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
第一滤光片 光源 狭缝 样品池 第 二 滤 光 片
样品
光源 程序
狭 缝
激发 单色器
表面 吸收 物质
发射 单色器
指示器
信号输出
检测器
荧光计示意图 记录器 荧光分光光度计示意图 放大器
检测器
48
可获得三维光谱图的仪器
如：日立4500型荧光分光光度计。
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
量
4.促使应用技术的发展
例如：时间分辨(相分辨)；同步荧光；三维荧光；荧 光光纤化学传感器
65
MFS与UV/Vis 法比较：
原理
灵敏度, 选择性
测定方法
I0 F It
UV/Vis 吸收
MFS 发射
10-5～10-6mol· -1 L
10-7～10-9 mol· -1 L
I0 F
66
第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis 磷光的发现
9
一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁
S1
S0
10
2. 单重态与三重态
处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳 定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 11
3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
vibrational relaxation
S0
l1
l2
l 2
l3
13
二、激发光谱和荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
S1
energy
T2 T1
phsophorescence
absorption
试样的荧光强度，进行比较：
Fs F0 Kc s Fx F0 Kc x Fs F0 Fs F0 cs cx cs Fx F0 Fx F0 c x
53
三、荧光分析法的应用
（一）药物（西药类）
1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶 囊的含量，测定波长为λex=287.0nm， λem=368.0nm。 2. 替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm 3. 氟康矬 λex=261nm , λem=284nm