酶学分析技术

10
（二）酶活性浓度
酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。 酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位 单位体积样本中的酶活性单位 IU/L或U/L表示 酶活性浓度才具有临床可比性， 表示。 用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数 情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性. 情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚 金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 血清ALP 与底物作用15min 1mg 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 血清在25℃ 3.0ml,光径 时每分钟测定吸光度下降0.001 即消耗4.82 0.001， 10NADH为一 时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 × 10-4μmol NADH为一 个卡门氏单位
3．Katal单位 Katal单位
定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 是在规定条件下 1mol 酶量。1Katal＝1mol/s。 酶量。1Katal＝1mol/s。
IU与Katal单位的关系： 60× IU， IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal 单位的关系
17
（二）Km的含义与意义 的含义与意义
的含义: 1．Km的含义:
V max =[S]时 可见K 值等于反应速率达到最大反应速率V 当Km=[S]时， v = ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 2 一半时的底物浓度。 一半时的底物浓度。
2．Km的意义 Km的意义
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 是酶的一个特征性常数 ），Km 反映酶对底物亲和力 酶对底物亲和力的大小 反映酶对底物亲和力的大小 最适底物或天然底物 选择酶的最适底物 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量 计算工具酶的用量
线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（ 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受 相对于时间（min） 的程度 。
前半段△A/min－后半段△A/min］ ［（前半段 A/min＋后半段△A/min）/2］ 100％ 前半段△ 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％
特点： 特点：
若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 [S] 成正比， 一级反应。 成正比，为一级反应。
15
四、酶促反应动力学
研究内容： 研究内容：
研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、 研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、 酶促反应的速率及其各种影响因素 酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）
6
一、酶活性
定义：酶活性（ activity）也称为酶活力， 定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指 酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成 酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成 或底物的减少量。 量或底物的减少量。 表示方法： 表示方法：
d [ P] v= dt
特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同， 特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较, 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
9
2.国际单位IU（ mol/min mol/min） 2.国际单位IU（µmol/min） 国际单位IU
11
三、酶促反应进程
吸 光 度 A
以产物生成量（或反 产物生成量（ 应物减少量）为纵坐标、 应物减少量）为纵坐标、 反应时间为横坐标作图所 反应时间为横坐标作图所 得到的一条曲线， 得到的一条曲线，称为反 应进程曲线（ 应进程曲线（或反应时间 曲线、速率曲线、 曲线、速率曲线、时间曲 线）
期
非 线 性 期 线 性 期
线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性 15％，
14
偏离线性期、 （三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）
进入非线性期的原因： 进入非线性期的原因：
反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、 反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反 应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降 等使得反应速率明显下降。 应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。
计算公式为： 计算公式为：
Vmax TN = [E ]
(单位是s-1) 单位是s
计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致） 计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
19
（四）Km和Vmax的测定
1、双倒数作图法： 双倒数作图法：
1/V
1
纵轴截距为 斜率为
Vmax
Km Vmax
− 1 Km
t1 图5-1
t2 酶促反应进程曲线
时间t
12
（一）延滞期（lag phase、延迟期 ） 、
特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢， 特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟
吸 光 度 A
延 滞 期
非 线 性 期
延 滞
孵 育 期
期
线 性 期
R1
R2
t1 5-1
t2
t
18
（三）Vmax的含义 的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率， 定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 表示在一定酶量时的最大反应速率 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。 应用：计算酶的转换数（ ，催化常数Kcat）单位时间内每 应用：计算酶的转换数（TN，催化常数 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
1/Vmax V -1/Km 0 1/[S]
横轴截距为
Linweaver-Burk作图法 作图法
20
利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质： 利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：
如竞争性抑制： 如竞争性抑制：
Km
Km 为表观Km 为表观K
21
第二节 酶活性单位的计算与校准
内容简介： 内容简介：
23
实测的酶 活性大小
mu t ⋅V m t V U= u u = u⋅ 0⋅ 0 m0 m0 tu Vu t0 ⋅ V0
规定的酶 活性单位
(5. 1)
酶活性单位的计算（掌握） 一、酶活性单位的计算（掌握） 二、酶活性单位的校准（了解） 酶活性单位的校准（了解）
22
一、酶活性单位的计算
（一）通用公式
m0 规定的产物生成量或底 物消耗量 1个酶活性单位 = = 规定时间 ⋅ 规定样本体积 t 0 ⋅ V0
前提条件：必须保证启始底物量充足（[S]》Km），使 前提条件：必须保证启始底物量充足（[S]》Km），使 ）， 酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最 酶促反应处于零级反应期即线性期， 大反应速率，从而使酶发挥最大活性——mu与酶活性正 mu与酶活性正 大反应速率，从而使酶发挥最大活性 mu 相关， 相关，而与启始底物量无关
研究意义: 研究意义
指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、 指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 选择底物种类 pH、激活剂和抑制剂类型与含量等 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性 或代谢物浓度。 或代谢物浓度。
16
（一）酶促反应
酶促反应式
K4
米氏方程： 米氏方程：
4
第一节 酶活性测定的基本知识
E E
绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 ）： 酶测定 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 ）：
5
简介内容： 简介内容：
一、酶活性 二、酶活性单位与酶活性浓度 三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学
13
（二）线性期
特点： 特点：可代表酶促反应速度
此阶段酶促反应速率基本保持恒定； 此阶段酶促反应速率基本保持恒定； 基本保持恒定 对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反 对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反 [S]的零次方成正比的 即不受底物浓度的影响， 应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比 ； 此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。 此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。 5% 为反应初速率 酶活性浓度越高， 酶活性浓度越高，线性期就越短
8
1．惯用单位： 惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 世纪60
ALP的金氏单位（King） ALP的金氏单位（King） 的金氏单位 举例： 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen） 举例： 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
酶活性的检测、 酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临 床诊断和疗效判断
2
主要内容： 主要内容：
酶活性测定的基本知识 酶活性单位的计算与校准 酶活性的测定 代谢物的酶法检测 同工酶测定
3
教学要求： 教学要求：
掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的 掌握酶活性单位的表示方法与计算、 酶活性单位的表示方法与计算 定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、 酶促反应进程 的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。 的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。 了解同工酶产生的机理与测定方法、 了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的 同工酶产生的机理与测定方法 校准、工具酶的应用。 校准、工具酶的应用。
第五章
酶学分析技术
1
酶（enzyme）的本质： enzyme）的本质：
由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质， 由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂
wk.baidu.com
酶的特点： 酶的特点：
高度特异性、高度不稳定性，高效性、 高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性
酶的应用： 酶的应用：
或
v=−
d[S ] dt
式中v 反应速率， ]：产物浓度， 时间，[S]：底物浓度。 式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
7
二、酶活性单位与酶活性浓度
（一）酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下， 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法： 表示方法： 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（ mol/min mol/min） 国际单位IU（µmol/min） IU Katal单位（mol/s） Katal单位（mol/s） 单位
IFCC,2001年 IFCC,2001年 37℃
定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化 mol 及其他最适条件）， 催化1 定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量， 1IU或1U，1IU=1µmol/min mol/min。 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1 mol/min。