微生物培养、筛选与保存

作业要求：
提交一篇小论文：XX菌落总数的检测报告 前言：介绍实验背景 一、材料与方法
二、检测结果
三、结果分析
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参考论文
三、食品微生物检验
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1.食品中菌落总数检测
菌落总数：食品检样经过一定处理，在一定条件 下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后， 所得1g（1mL）检样中形成的微生物菌落总数。
检 分离培养 染色镜检 验 致 纯 生化试验 前 病 化 的 菌 增 分离 血清学试验 准 菌 培养 备 动物试验
二、食品微生物样品采集与制备
取样：代表性 微生物检验的取样过程中，避免操作引起污染。
一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，
即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放
入消毒容器中。
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用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面
积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容
器中。
③ 车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别
置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖 送检。
平皿
（七）采样标签的填写
标签内容主要：
编号、样品名称、生产单位、生产日
期、产品批号、产品数量、存放条件、
菌落计数以菌落形成单位（cfu）表示
国标规定：在需氧情况下，37℃培养48h，能在 普通琼脂平板上生长的细菌菌落总数 不能生长的细菌：厌氧菌，微需氧菌，有特殊营 养要求的，非嗜中温的细菌
菌落总数主要用作判定食品被污染程度的标志
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食品中菌落检测方法P116
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2.食品中大肠菌群检测
大肠菌群：一群在一定培养条件下能发酵乳糖、 产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。 多存在于温血动物粪便。
（一） 检验前的准备
1. 2. 3. 4. 5. 6.
准备好所需的各种仪器，如冰箱、水浴锅、培养箱等。 按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭 菌，冷却后送无菌室备用。 准备好所用的各种试剂，制备营养琼脂或其他培养基。 做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前灭菌 30~50min. 准备好采样必需的工具和器材，如剪刀、镊子、勺子等。 采样后样品运输、保存相关准备。
二、生长曲线的测定
任务一：认识生长曲线的概念 任务二：为生长曲线的绘制设计实验方案
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任务一：什么是生长曲线
什么是微生物的生长曲线
生长曲线的制作： 接种 适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积 的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养， 每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养 时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵 坐标，绘制所得的曲线。
（1）实验原理
（2）材料与方法 （3）预期结果
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接下来请大家汇报实验方案
本次的作业：请大家设计实验方案，要求包括： （1）实验原理 （2）材料与方法
（3）预期结果
A4纸打印上交
四、食品微生物检测
一、食品微生物的检验流程 二、食品微生物样品采集与制备 三、食品微生物检验
1.食品中菌落总数检测
充分混匀后，无菌操作打开包装， 用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛 样容器.
2、半固体样品采样方法
无菌操作打开包装，用无菌勺子从几 个部位挖取样品，放入无菌容器。
3、固体样品采样方法
大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割 取，并注意其代表性； 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品， 放入无菌容器。 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为 检验食品品质的情况，应从深部取样。
2.食品中霉菌和酵母菌检测 四、制定实验方案
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食品检验的目的
1.便于食品卫生质量监督管理； 2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质 3.为新产品、新资源利用、新食品等进行卫生鉴
定
一.食品微生物检验的一般步骤
样 品 保 样 存 品 采 集 选 择 参 考 菌 群
样 品 处 理
菌落总数
结果报告
大肠菌群
等。
5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。
食品微生物检验的采样方案
微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批 食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也 即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。 要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用 正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原 有状态。 目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方 案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。 对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不 少于8件。
一、复习 二、微生物的生长曲线 三、微生物的生长曲线的测定--方案汇报 四、食品微生物检测
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1.微生物菌种的保藏
为什么要进行菌种保藏 菌种保藏的目的 菌种保藏的原理
菌种保藏的方法
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斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
幅要大于40cm。
3.研磨法
将中样(≥100g)剪碎 或搅拌混匀，从中取25g 检样放入无菌乳钵中充分 研磨后，再放入带有 225mL无菌稀释液的稀释 瓶中，盖紧盖后充分摇匀。
4.整粒振摇法
直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和 直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖， 用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
2.盒装或软塑料包装样品的处理
将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子
剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在
剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容
器中再取样25mL检验。
（二）固体样品的处理
1. 捣碎均质法 2. 剪碎振摇法 3. 研磨法 4. 整粒振摇法 5. 胃蠕动均质法
采样时间、采样人姓名，现场情况。
×××××采样单
样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 产品名称（商品名）______规格型号__________注册商标_____________ 生产厂家_______________通讯地址__________邮政编码□ □ □ □ □ □ 受检地点_______________通讯地址__________邮政编码 □ □ □ □ □ □ 采样地点_______________采样日期__________采样基数______________ 生产日期_______________批 号__________产品依据标准__________ 有效成分及含量 ____________________________________________________________ 检验目地________________检测项目_____________________________
（三）冷冻样品
冷冻样品，先将中样在0~4 ℃下解冻，时间不能超
过18h，或在45 ℃下解冻，时间不能超过15min。
再取检样25g做稀释处理。
请大家参考p229 附录五 中国食品微生物限量规 定列出的食品，选择一种制定样品的采集与制备 方案，包括：
1）选择何种食品
2）用品准备 3）样品采集具体操作步骤 4）样品处理具体操作步骤
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将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条 件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡 期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对
数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌
的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同
样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不 相同。
1.捣碎均质法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从 中取25g放入带225mL稀释液的无菌 均质杯中，8000~10000r/min均质
1~2min即可。
视频：无菌均质器
2.剪碎振摇法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进
一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃
珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振
菌种复壮的主要方法
1百度文库纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典 型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型
性状。
平板表面涂布法
菌落纯（“菌种纯”）
平板划线分离法 琼脂培养基浇注法 用分离小室进行单细胞分离
细胞纯（“菌株纯”）
用显微操作器进行单细胞分离 菌丝尖端切割进行单细胞分离
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哪些情况下需要测定微生物的生长 曲线？
1.工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)
的菌体，以尽量缩短停滞期。 2.分子生物学实验中，选择对数期的菌体，制备
感受态细胞，进行基因工程实验
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任务二：设计实验方案
1. 任选大肠杆菌或酵母菌 2.结合实验室实际情况，设计实验方案，要求包 括：
4、冷冻食品采样方法
大包装小块冷冻食品按小块个体采取； 大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无 菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。 若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检 验食品品质情况，应从深部取样。
5、生产工序监测采样
① 车间用水：从车间各龙头采样； ② 车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：
ICMSF(The Intermational Committee on Microbiological Specification for Food)
国际食品微生物标准委员会
食品微生物检验采样方法
采样原则： 能采取完整包装的样品就不拆开 取样，必须拆开包装取样的应按无菌 操作进行取样.
1、液体样品采样方法
2、菌种的复壮
狭义的复壮－－消极的措施 指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种 分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰 退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到 恢复原菌株固有性状的相应措施。


广义的复壮－－积极的措施
指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，
就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工 作，以期从中选择到自发的正突变个体。
大肠菌群数的高低表明了粪便污染程度
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食品中大肠菌群检测P119
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3.食品中霉菌和酵母菌检测
食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得 1g或1mL检样中所含霉菌和酵母菌菌落数。
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食品中霉菌和酵母菌检测P122
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四、制定实验方案
请大家参考课本，并查找国标法，制定XX食品 中霉菌数的检测方案，包括： 1.实验所需仪器与材料
五.样品的处理方法
（一）液体样品
（二）固体样品
（三）冷冻样品
（一）液体样品的处理
1. 瓶装液体样品的处理 2. 盒装或软塑料包装样品的处理
1.瓶装液体样品的处理
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸 或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将 盖启开； 含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿 盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部 逸出后，取样25mL检验。
样品的种类
1. 大样，就是一整批； 2. 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，
一般每批抽样数量不少于5件，一般为200g； 3. 小样，也称检样，直接进行分析用的，一般 为25g。
食品微生物检验的采样方案
① ② ③ ④
ICMSF取样方案；
美国FDA的取样方案；
世界粮农组织（FAO）取样方案；
我国的食品取样方案。
采样人仔细阅读以下句子，然后签字 我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填 写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和 公正性。
代表单位（章） 签字 日期 年 月
备 注
日
代表单位（章） 签字 日期 年 月
日
四.样品的送检要求
1、要快速运送：不要超过3小时； 2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送； 3、要注意防污染、防散漏、防变质； 4、要填写检验申请单。
2.取样的方法
3.霉菌数测定的方法
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汇报实验方案
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作业要求：
提交一篇小论文：XX食品中霉菌数的检测报告 前言：介绍实验背景 一、材料与方法
（二）样品的采集
采样的步骤
采样前调查→现场观察→确定采样方案 →采样 →样品封存 →开具采样证明
采样的原则
1、根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生 物的危害程度等确定采样方案
2、应采用随机原则，确保所采样品必须具有代表性。
3、采样操作必须遵循无菌原则，要防止污染，防止变 质、损坏、丢失。严格遵守样品采集的操作规程。 4、样品在保存和运输过程中，应采取措施防止样品中 原有微生物数量的变化，不得加入防腐剂、固定剂