石蜡包埋组织的DNA提取
四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较
四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较袁亚婷;江岳鑫;尹小文;江兴堂【摘要】背景:由于在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中对DNA造成的损害,影响了后续的聚合酶链反应等研究.选择一种简便有效且经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法成为研究者们关注和亟待解决的问题.目的:比较甲醛固定石蜡包埋组织中4种提取DNA的方法对DNA质量的影响,探讨一种操作简便、污染少、经济实用的石蜡包埋组织中提取DNA的方法.方法:取手术切除的普通甲醛固定石蜡包埋的非小细胞肺癌组织标本20例,分别以二甲苯脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、试剂盒法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法提取其DNA,然后进行电泳分析、紫外分光光度计测定A260/A280比值及PCR扩增.结果与结论:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法可获得较大的DNA片段,且两种方法与试剂盒法所提取DNA的A260/A280值相比较,均有显著性意义(P<0.05),4种方法的提取效率差异无显著性意义(P>0.1),以改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法所得DNA为模板,扩增的目的条带亮度与阳性对照相当.结果证实改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法简便有效,所用试剂价格低廉,是一种经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)024【总页数】5页(P4430-4434)【关键词】甲醛;石蜡包埋组织;DNA提取【作者】袁亚婷;江岳鑫;尹小文;江兴堂【作者单位】厦门大学医学院,福建省厦门市,361004;厦门大学医学院,福建省厦门市,361004;厦门大学附属中山医院呼吸内科,福建省厦门市,361004;厦门大学附属中山医院呼吸内科,福建省厦门市,361004【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded tissue，FFPET)具有便于运输，可长期保存等特点，是最常用的人类病历档案标本[1]。
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤注意事项需要自备材料：二甲苯、无水乙醇、异丙醇、磁铁或磁架、1.5mL离心管(最好低吸附的离心管)；需要去除RNA自备RNase A（100mg/ml），在蛋白酶K消化这一步加入4 μl RNase A；◆整个过程请勿离心，以免磁珠不可逆聚集而影响提取效果。
实验准备磁珠用前一定要充分混匀；◆56℃和80℃加热源；◆使用前需在Buffer FTGWI中加入相应体积的无水乙醇，使乙醇比例占80%。
操作步骤1.脱蜡：①切下5 片厚度约为10μM（重约10mg）的组织块，尽量切去石蜡部分，置于1.5ml的离心管中。
加入1ml二甲苯，并振荡30s，然后室温放置5分钟。
20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移尽上清。
②加入1ml 100%乙醇振荡离心管20s，然后20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移去上清，室温干燥组织沉淀15min。
注意：任何残留的乙醇可能会影响蛋白酶K的消化以及减少核酸的得率2. 消化：加300 μL Buffer FTGL，振荡至彻底悬浮，用匀浆机进行匀浆破碎（使其彻底无大块组织残留），再加入20 μL蛋白酶K(PK)，于56℃温浴15min （期间不时混匀），然后置于80℃ 15min；注意：①组织大于50mg时需要增加蛋白酶K (PK)的用量。
3. 裂解结合：将离心管从80℃加热器上离开，冷却至室温，在上清液中加入600 μl Buffer FTGB和600uL 异丙醇，最后加入磁珠悬浮液(MB) 30 μL（使用前充分重悬），颠倒混匀5分钟；将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
4. 漂洗:(1) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW0,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，重复该步骤一次。
(2) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW I,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬,将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
从石蜡组织中提取DNA
石蜡包埋组织DNA提取方法
一脱蜡：
1、切取石蜡组织5-10片（5um—7um）放入1.5ml的离心管中；
2、加入1ml二甲苯，55°10min，离心轻弃上清，重复两到三次（因组织而定）；
3、加入1ml无水乙醇，室温三分钟，重复二次，离心弃上清，并干燥待酒精挥发。
二消化：
例：设置250ul体系，加入2x裂解液125ul、10%SDS 5ul、蛋白酶k25ul（1mg /ml）、纯水95ul（以上根据裂解液、SDS、蛋白酶K的配置浓度不同和组织量多少而需重新设置），55°消化过夜（按组织的消化情况而定，若没消化完全可适量加入蛋白酶k），直至组织完全液化。
三抽提：
1、加纯水至500ul，加入Tris饱和酚250ul，颠倒混匀，静置5min，再加入250ul 氯仿，颠倒混匀静置5min ，瞬时离心，
2、取出上清液至1.5ml离心管中，加入500ul氯仿，轻混匀，室温静置5min瞬时离心；取上清400ul（吸取液体量可比总体积小，避免吸到蛋白）
四沉淀DNA ：
1、加入3M醋酸钠40ul（醋酸钠的量是吸取上清体积的十分之一），轻混匀，加入880ul无水乙醇（两倍体积）混匀，-20°过夜。
五收集DNA
1、13000rpm 15min，离心轻弃上清
2、加入75% 1ml酒精轻洗，即刻13000rpm 5min 轻弃上清，空气干燥（可用55℃），待干燥为止。
六加入50-100ul纯水溶解，30分-1小时。
关于甲醛固定石蜡包埋组织提取DNA质量的探讨
关于甲醛固定石蜡包埋组织提取DNA质量的探讨*杜 靖1**,古丽孜亚 卡克巴依1,海米提 阿布都力木2***(新疆医科大学1厚博学院机能教研室,2基础医学院组胚教研室,新疆 乌鲁木齐 830011)摘要:目的:探讨甲醛固定石蜡包埋组织(F FP ET)提取D NA后PCR扩增产物检测率的提高。
方法:应用从FF PET提取的D NA,PCR反应扩增 Glo bin(110bp),分析纯化前后DN A P CR产物的检测率。
结果:纯化后的DN A模板PCR反应取得高质量目的基因。
结论:纯化后能有效去除不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子,利于P CR反应成功。
关键词:石蜡包埋组织;DN A;PCR;纯化中图分类号:R36;R34 文献标识码:A 文章编号:1009 5551(2008)09 1146 02Further study on the quality of DNA extracted from formalin fixed andparaffin embedded tissuesDU Jing,Guliziya Kakebayi,Haimiti Abudulimu(Dep ar tment of Medical P hy siology&Biochemistry,X inj iang M edical Univ er sity,Ur um qi830011,China)Abstract:Objective:Study the effect of DNA purificatio n after extraction from formalin fixed and paraffin em bedded tissues(FFPET)on PCR amplification efficiency.Methods:Co mpared the PCR amplification ef ficiency of DNA sam ples ex tr acted fro m formalin fix ed and paraffin embedded tissues and the DNA samples further purified by U NIQ 10spin colum n after extractio n using specific primers and optim ized PCR condi tions for g lobulin(110bp).Results:Further purificatio n of DNA sam ples w ith U NIQ 10spin co lum n af ter DNA ex traction increased PCR am plificatio n efficiencies for the g ene studied in all sam ples w ere com pared to the DNA samples w itho ut further purification step.C onclusion:Further purification of DNA sam ples w ith U NIQ 10spin column after extraction remov es the PCR inhibiting factors that could not be re m oved by proteinase K in the DNA tem plates fr om formalin fix ed and par affin embedded tissues,and in creases the sensitivity o f PCR amplification.Key words:FFPET;DNA;PCR;purification肿瘤的分子生物学研究是当今的热门课题之一,聚合酶链反应(Poly rmerase chain r eaction, PCR)技术应用于病理诊断和辅助诊断工作,其价值已不断受到重视。
石蜡包埋组织中3种DNA提取方法的比较及优化
活检肿瘤组织 ｌ ， ５例 包括 软组织 肿瘤 ３例 、 腺癌 ４例 、 乳 食 管癌 ５例 、 巴瘤 ３例 ， 淋 所用组织 均经 １ ％ 中性 福尔 马林 固 ０
述 提 取 Ｄ Ａ方 法 成 功 率 为 ６ ％ ～８ ％ ， 此 提 取 Ｄ Ａ Ｎ ０ ０ 因 Ｎ 的质 量 、 度 、 纯 片段 的长 度 决 定 后 续 实 验 的 成 功 与 否 。 同 时 ， 对 石 蜡 组 织 提 取 Ｄ Ａ 前 样 本 的量 在 很 多 文 献 中描 述 不 一 ， Ｎ
针对提取 Ｄ Ａ的方法不 同 ， Ｎ 选择最合适 的组织 样本量 ， 本组 研究通过 比较不 同抽 提方法 对肿瘤 组织 不 同蜡膜 用量 所得 Ｄ Ａ质量 ， Ｎ 总结 ３种 提取 Ｄ Ａ的方法对 应最合 适 的蜡 膜用 Ｎ 量， 建立标 准化操作 程序 。
１ 材 料 与 方 法 １１ 材 料 ． 随机 选 择 新 疆 石 河 子 大 学 医 学 院 一 附 院 病 理 科
察： 除去坏死 、 出血 、 间质成 分 ， 肿瘤组 织 占整个蜡 块组 织面 积 的百分数 ， 计算实际肿 瘤组织 面积 ＝蜡 块 的长 （ ｍ）×宽 ｅ （ｍ） ｅ ×肿瘤组织 面积 占蜡 块组织 面积 的百分 比（ ， ％） 常规 消毒所用物 品， ｍ厚 连续切蜡 膜 １ ５ ０张 、 ６张、 ３张 ， 各切 ３
ｄ Ｔ ． ｌ１ｇ ｂｎ引 物 ０ ５ ｌＴ ｑ Ｎ 聚 合 酶 ０ ３Ｉ 、 Ｎ Ｐ０ ５ 、 －ｌ ｉ ３ ｏ ． 、 ａ Ｄ Ａ ． ｌ ｘ 模 板 Ｄ Ａ ｌ 应 条 件 ：４℃ 预 变 性 ５ ｍｎ ９ ℃ 变 性 ３ Ｎ ２ 。反 ９ ｉ，４ ０
石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测价值评价
石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测价值评价摘要目的探讨分析石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测的价值。
方法63份经石蜡包埋的组织，随机分为实验组（32份）和对照组（31份）。
实验组采用DNA快速提取法，对照组采用试剂盒DNA提取法。
分别对两组提取出的DNA进行对比分析。
结果实验组在小组织标本中提取DNA的浓度及纯度均低于对照组；实验组在大组织标本中提取DNA的浓度及纯度与对照组比较无显著差异。
对照组中提取的DNA扩增后可达到500 bp以上，实验组扩增产物则在400 bp以上。
结论分子病理检测中应用石蜡包埋组织DNA快速提取法，可在保证质量的情况下，大大缩短检测时间，提高检测安全性，临床上值得应用。
关键词分子病理检测；石蜡包埋组织；DNA快速提取法；价值近年来，随着分子病理学的不断发展，人们对肿瘤疾病的认识与研究不再局限于患者的器官、细胞，而是延伸到了蛋白质、DNA等水平。
分子病理学使病理诊断变得更加准确、客观，而且在肿瘤的治疗及预后等方面也有着重要价值，其中免疫检测、基因检测、流式细胞术等技术目前应用较为广范，全面推动着医疗技术的发展[1]。
提取DNA是分子病理检测的重要内容，本研究通过对石蜡包埋组织进行DNA提取、分析，旨在评价石蜡包埋组织DNA快速提取法应用于分子病理检测中的价值，现报告如下。
1 材料与方法1. 1 材料选取2016年3～12月经石蜡包埋的组织63份，将其随机分为实验组（32份）和对照组（31份）。
所有标本均使用中性甲醛固定，其中淋巴结、肿瘤、宫颈组织各21份。
1. 2 方法1. 2. 1 实验组采用DNA快速提取法，对每例标本制作4张蜡片，首先将蜡片置入离心管中并加入裂解液，采用金属浴方法将石蜡溶解，并将温度控制在95℃，持续时间在10 min左右，然后以14000 r/min对其进行离心操作，离心过程持续5 min，最后将蜡层下出现的清凉溶液置于-20℃环境下保存。
从石蜡包埋组织中提取DNA
基因突变检测实验操作流程一、DNA提取1.Extract RNA（详见QIAGEN Rneasy FFPE Kit,货号74404）注意：所有的离心步骤均在室温下进行。
1)用刀片切除多余石蜡，暴露组织。
2)切片厚度为5-10um（若样本表面已暴露于空气中，则弃掉刚开始的2-3片）。
3)迅速将样本切片放入1.5或2.0ml的小离心管中，加入1ml的二甲苯，盖上管盖，旋涡样剧烈振荡10s。
4)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
5)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
6)加入1ml乙醇（96-100%），旋涡样充分混匀。
7)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
8)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
9)打开管盖，在室温或37℃下放置10min，直至残留乙醇挥发完。
10)加入180ul缓冲液ATL重悬沉淀，再加入20ul蛋白酶K，充分混匀。
11)于56℃孵育1h（直至样品完全溶解）。
12)90℃孵育1h。
13)稍稍点动离心去除管壁上的液体。
14)加入200ul Buffer AL 于样品中，充分混匀，再加入200ul乙醇（96-100%），再次充分混匀。
15)稍稍离心去除管壁上的液体。
16)将所有的液体混合物转移至QIAamp吸附柱内（套在2ml的收集管内），垂直加入，不要湿润管壁，盖上管盖，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
17)小心打开QIAamp吸附柱，垂直悬空正中加入500ul Buffer AW1，不要加到管壁上。
盖上盖子，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp 吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
18)加入500ul Buffer AW2于QIAamp吸附柱内，8000rpm离心1min，弃掉收集管和管内液体，并将QIAamp吸附柱置于一个干净的2ml收集管中。
19)14,000rpm离心3min。
石蜡包埋骨组织的DNA检验
１ 材 料 与 方法
１ ． １样 本
骨组 织 ， 本身存在变异 ， 故 未 检 出全 部 基 因座 可 能性 大； ５号 切 片样本 是 正常 组织 ， 故 检 出全部 基 因座 。
脱蜡洗涤是 能否成 功提取 Ｄ Ｎ Ａ 非 常 关 键 的步 骤 。对于 石蜡 包埋 组织 的 Ｄ Ｎ Ａ提 取必 须保 证 石蜡 完
液， 留沉 淀 。把 上述 脱 蜡 后 的样 本 用 酚 一 氯 仿 法提 取
Ｄ Ｎ Ａ备 用 。 采用 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 、 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳 银 染 的方 法 对 上 述
［ ２ ］陈玲 ， 刘超 ， 王慧君 ， 等．多重 置换 扩增 技 术 用 于法 医 学
微量 Ｄ ＮＡ 检 测 效 果 ［ Ｊ ］ ． 证据 科 学， ２ ０ ０ ８ ， １ ６ （ ６ ） ： ７ ５ ２ — ７ ５ ６ ．
皮 样 细胞 团 ） 、 ３号 （ 骨 组织 中见 可 疑肿 瘤 ） 、 ４号 （ 骨 组 织 中未 见 可疑肿 瘤 ） 、 ５号 （ 正 常骨组 织 ） 。
１ ． ２ 方 法 按 编号 把石蜡 切 片小 心剥 离 ， 放入 １ ． ５ ｍＬ离 心 管
苯 溶 解并 过夜 ， 保 证石 蜡充 分溶 解 于二 甲苯 。用梯 度
数对 Ｓ Ｔ Ｒ扩增 成 功率 的影 响［ Ｊ ］ ． 中国法 医 学杂志 ， ２ ０ ０ ５ ，
２ ０ （ ３ ） ： １ ５ １ － １ ５ ３ ．
弃 上清 液 ， 留沉淀 。沉淀 加 １ ． ５ ｍＬ ９ ５ ％乙醇溶 液 ， 室
温静置 ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， 以离 心 半 径 ５ ｃ ｍ， １ ０ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ， 离 心 ５ ａｉ ｒ ｎ ， 弃 去上 清 液 。再分 别 用 ８ ０ ％、 ７ ５ ％、 ７ ０ ％乙醇溶 液各 洗涤 １次 。 待 乙醇 挥 干后加 Ｔ Ｅ Ｓ液 １ ． ５ ｍ Ｌ， 振荡 ， 以 离心 半径 ５ ｃ ｍ， １ ０ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， 离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 弃 去 上清
甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较
文章编号:100126325(2004)0320335204甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较田子强,刘俊峰,张少为,李保庆,王福顺,曹富民,张月峰(河北医科大学第四医院胸外科,石家庄050011)摘要:为了寻找最佳的自普通10%甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法,取我院2000年手术切除的10%甲醛固定石蜡包埋的食管癌标本10例,分别以蛋白酶K消化酚氯仿抽提法,蛋白酶K消化氯化钠盐析法和不同pH 值下加热提取法提取其DNA,然后进行电泳和PCR扩增分析。
结果显示,蛋白酶K消化酚氯仿抽提法,蛋白酶K消化氯化钠盐析法所得DNA产量和质量均高于不同pH值下加热提取法。
从而认为蛋白酶K消化氯化钠盐析法简便快捷,不用接触有毒的化学药品,是理想的DNA提纯方法。
关键词:DNA提取;PCR;石蜡包埋组织;10%甲醛固定组织中图分类号:R36112 文献标识码:A 10%甲醛固定手术标本已有数十年的历史,目前国内大多数医院及科研机构均用普通10%甲醛固定手术标本。
已有研究证明普通10%甲醛固定石蜡包埋组织中的DNA降解相对严重,从这些蜡块中提取高质量的DNA更加困难,本文的目的是为了探索自普通10%甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的最佳方法:1 材料与方法111 取材随机选取我院2000年手术切除的10%甲醛固定石蜡包埋后在通风干燥处妥善保存的食管癌标本10例,仔细检查无霉菌和细菌污染后,常规切片HE 染色,显微镜下观察确保组织结构清晰,无自溶,坏死和大片出血后,切取10μm厚切片,每2片放入一个115m L无菌管中,每例标本共取28片,分别放入14个无菌管中。
112 蛋白酶K消化酚氯仿抽提法取相应10例标本各1管提取DNA,参照Sam2 brook(1989)的方法[1],主要步骤为二甲苯脱蜡后,向管中加入500μL的TES溶液,30μL蛋白酶K(10gΠL)溶液,30μL20%的S DS,混匀后56℃旋转消化72h,每24h加入等量蛋白酶K一次。
石蜡包埋组织的DNA提取及影响因素
• 2.1 有机溶剂脱蜡法
• 二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂 。首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于 室温下脱蜡，一般进行两次，分别为2h和12h。 然后用梯度乙醇(100%至70%)复水，使组织结构 疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕量的二
甲苯和甲醛。待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消
• 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是 一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡 切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物 学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过 对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细 胞化学的发现。
• Goelz(1985)成功地从蜡块中提取出高质量 的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物 学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新 鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛 地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤 发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断 研究和患者预后评估等方面均具有重要价 值。
化缓冲液。根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的 温度(48℃或65℃)、增加脱蜡的次数、延长脱蜡 或复水时间等。该法脱蜡比较彻底，利于组织消 化，但是过多的操作步骤增加了DNA受污染的可 能，亦容易人为地造成DNA机械性损伤，并且需 要接触有毒物质二甲苯。
• 2.2加热脱蜡法
• 通过加热使石蜡溶解，继而从组织中分离 出来的方法，比较省时省力，同时也避免 了接触有毒化学试剂。但DNA受热后不稳 定，组织内释放出的一些金属离子以及核 酸酶等易对其造成损伤，加热温度越高时 间越长，DNA受损则越严重。另外, 组织受 热不均, 脱蜡有不彻底的可能。
但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱 基序列，效果远不如其他两种情况[7]。
DNA提取的预处理—脱蜡
一种从石蜡包埋组织中快速提取DNA的方法
张 惠丹 任 ，
摘 要： 目的
组 织 切 片 直接 浸 入 １０ ｔ 消化 液 中 ，６℃ 孵 育 ０ ５ｈ １ｈ和 ２ｈ 灭 活 蛋 白酶 Ｋ后 离 心取 上 清 即为 Ｄ Ａ提 取 物 。琼 脂 糖 凝 胶 ５ ｌ ｔ ５ ． 、 ， Ｎ
电泳检测所提取 Ｄ Ａ的片段分 布 ， Ｎ 紫外分光光度法测定 Ｄ Ａ的产量及纯度。以提取 的 Ｄ Ａ为模板 ，Ｃ 扩增不 同长度产物 Ｎ Ｎ ＰＲ
ｐｔ ， ｈｎ ａ ｇ １ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｉ ｌ Ｓ ｅ ｙ ｎ ０ ２ ｈｎ ） ａ １
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｐｕｒ ｓ Ｔｏ ｅ ｔｂｌｓ ｏ ｒｕｌｏ ｅ ｓｅ ｔｏ ｏ ａ ｄ ＤＮＡ ｘｒ ｃｉｎ ｆｏ ｆｒ ｌｎ ｆｘ ｄ ｐ ｒ ｆ ｎ ｅ ｔａ ｔ ｐｏ ｅ ｓａ ｉｈ ａ ｐ ｗｅ ｆ ｎ —ｔ ｐ ｍｅｈ ｄ ｆｒｒｐｉ ｅ ｔａ ｔｏ ｒ ｍ ｏ ｍａｉ — ｅ ａ ａ — ｍｂｅ ｅ ｉｓ ｅ ． ｉ ｉ ｄｄ ｄ ｔｓ ｕ ｓ Ｍ ｅｈｏｄ Ｏｎｅ １ Ｉｍ ｒｈｉａ ｉｓ ｅ ｔｏ ｓｄ ｒ ｃｌ ｌｃ ｄ ｉ ｏ ｔｅ ｄ ｇ ｓｉｎ ｂｕｆ ｒｗｉ ｏ ｎ ｒ ｔｅ ｔ ｎ ｎｄ ｉｃ ａｅ ｔ ｔ ｓ ｘ ａｃ ｖ ｌｔｓｕｅｓ ｃ ｉｎ ｗａ ｉｅ ｔｙ ｐａ ｅ ｎｔ ｈ ｉｅ ｔｏ ｆｅ ｔ ｕｔａ ｙ ｐ ｅｒ ａｍｅ ｔａ ｎ ｕｂ ｔｄ ａ ０ ｈ ５６ ℃ ｆ ｒ０． １ ｈ ａ ｅ ｐ ｃｉ ｅｙ，ａ ｄ ｔｅ ｕ ｍ ｉｅ ｏ ｉａ ｔｖ ｔ ｎ ｏ ｒ ｔｉａｓ ａ ｄ ｃ ｔｉｕ ａｉｎ． Ｇｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｎ ｔ Ｕ ｏ ５ ｈ． ｎｄ２ ｈ ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ｎ ｈ ｎ ｓ ｂ ｔ ｄ ｔ ｎ ｃ ｉａｉ ｆｐ ｏｅｎ ｅ Ｋ ｎ ｅｎｒｆ ｇ ｔｏ ｔ ｏ ｎ ｍｉ ｉ ｈｅＳ — ｐ ｒ ａａ ｔｗａ ｕａ ｔ ｅ ｎｄ ｑｕ ｌｆｅ ｙ ＤＮＡ ｌｃｒ ｐ ｒｓｓ，ｓ ｅ ｔｏ ｈｏｏ ｔｙ ａ ｄ ｕ ｅ ｓ ｔ ｅ ｔｍ ｐａ ｅ ｏ ｌｍｅａｓ ｈ ｉ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔｎ ｓｑ ｎｉ ｄ ａ ａｉ ｄ ｂ ｉ ｆ ｉ ｅｅ ｔｏ ｈｏｅ ｉ ｐ ｃｒ ｐ ｔｍｅｒ ｎ ｓ ｄ ａ ｈ ｅ ｌｔ ｆｐｏｙ ｒ ｅ ｃ ａｎ ｒ ａ —
福尔马林固定_石蜡包埋组织中提取DNA的实验研究_
综述从石蜡包埋组织中提取DNA及对PCR的影响从多年存档的常规福尔马林固定－石蜡包埋病理标本中提取高质量DNA可以解决在短期内难以搜集到大量有用标本的难题。
但在福尔马林固定过程中常常出现DNA降解，不易获得大分子量DNA，使绝大多数分子生物学实验受限，因此从福尔马林固定－石蜡包埋组织中提取高质量DNA 可以解决分子生物学实验过程中缺少实验材料的难题，本节就不同的提取DNA的方法、标本固定过程对PCR模板的影响、DNA提取各步骤应注意的事项及如何获得满意的PCR扩增结果进行综述。
第一节、固定液、固定时间对DNA模板的影响DNA[1]。
Gall 等用6种固定液固定脑组织，它们分别为：①含缓冲液的10%的福尔马林；②1%多聚甲醛；③丙酮；④AMeX固定法；⑤Carnoy固定液；⑥Bouin固定液。
然后以相同的方法提取DNA，用于扩增317bp的β-肌纤蛋白基因。
发现第1、4、5种固定液中提取的DNA可以获得满意的扩增结果；而第2、3种固定液扩增效果较差；所有用第6种固定液固定的标本提取的DNA均未见特异性目的基因扩增条带[2]。
其他报道也证明：就固定组织中提取的模板质量及PCR有效扩增而言，甲醛固定优于多聚甲醛、B5及Bouin氏液[3-5]，含缓冲液的10%[6]，而用AmeX 方法固定，不仅能保护在福尔马林固定过程中破坏的抗原，而且可以提取到大分子量的DNA进行Southern杂交。
此外固定时间也明显影响DNA的提取质量。
Ohara等在室温下用市售的10%福尔马林溶液（终浓度为3.7%甲醛和1%甲醇）固定等量的MT-2细胞，时间分别为4小时、1、4、10天、1个月。
提取DNA后经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示：细胞固定时间少于4天的，可以见到较明显的大分子量条带；而固定超过4天仅见碎小片段[6]。
Roger10%福尔马林，将标本固定不同时间后（6、24、48、72小时、1、2、3、4周），提取DNA，用于C-K-ras基因（135bp）的扩增，发现：固定时间少于48小时，扩增效果无影响；固定72小时至1周，仅信号强度有些减弱；若超过1周则扩增效果明显减低[8]。
石蜡组织DNA提取SOP
石蜡组织DNA提取SOP提取石蜡包埋组织基因组DNA标准操作规程1. 目的：由石蜡包埋组织中提取出基因组DNA，以保证后续检测的正常进行。
2. 操作者：病理科负责取材的技术员、病理医师以及分子病理技术员。
3. 准备工作：3.1 56℃和90℃水浴锅3.2二甲苯或无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)3.3无水乙醇3.4蛋白酶K溶液：每管干粉状的蛋白酶K中加入1.1ml蛋白酶K 溶解液，颠倒让蛋白酶K充分溶解，分装保存于-20℃。
3.5洗涤液GW1使用前，须加入17ml无水乙醇进行稀释。
3.6洗涤液GW2使用前，须加入80ml无水乙醇进行稀释。
4. 步骤：4.1标本接收：分子病理技术员负责核对送样登记表所记录的病理号与标本编号是否一致，要求10um肿瘤组织病理石蜡切片不少于4张，可以是已经切好并放在载玻片上的切片；所有切片均应是未经染色的白片。
4.2脱蜡(可按以下方案A或方案B去除石蜡）：方案A：二甲苯去除石蜡(经典方案)A1：石蜡蜡卷A1-1：将石蜡切片置于1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧涡旋振荡10s，13000r/min 离心2min，吸去上清，保留沉淀；如脱蜡不完全，可重复该步骤一次。
A1-2：向离心管中加入1ml无水乙醇，涡旋振荡混匀，13000r/min离心2min，吸弃上清，用移液器吸头小心将组织摊开粘附于管壁，置于恒温加热器（预先设置为37℃）10min晾干，直到乙醇完全挥发，之后按4.3步骤进行操作。
A2：石蜡切片A2-1：将组织切片置于二甲苯浸泡10分钟，两次；A2-2：无水乙醇浸泡5分钟，一次；A2-3：蒸馏水中浸泡，刮取肿瘤区域到1.5ml离心管中，之后按4.3步骤进行操作。
方案B：无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)去除石蜡B1-1：加入0.5ml Deparaffinization Buffer至样品中，剧烈涡旋10s。
10-石蜡组织切片DNA提取操作流程(ADx)
石蜡组织切片DNA提取操作流程实验目的本实验使用二甲苯和QIAamp DNA FFPE Tissue 试剂盒相结合的方法抽提石蜡包埋组织DNA，有效减少PCR抑制剂对后续实验的影响。
实验材料∙二甲苯∙吐温 20∙一次性解剖刀∙ 1.5 ml 离心管∙无水乙醇∙振荡器∙干浴∙冷冻离心机∙QIAamp DNA FFPE Tissue Kit （QIAGNE Cat No: 56404）实验步骤步骤一：切片组织刮取步骤二：DNA脱蜡及消化步骤三：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 提取DNA步骤一：切片组织刮取经过病理评估的组织切片，需事先将肿瘤区域标识出来。
通常本方法使用适当数量5µm厚度切片，刮取肿瘤组织面积约4cm2抽提的DNA量足够检测之用。
DNA提取的得率和质量很大程度上取决于组织本身的性质以及切片制备情况。
1．将相应的样本号标识于1.5mL离心管上。
2．吸取微量(2µl ~ 8µl，根据肿瘤标识区域面积决定吸取的量)的吐温20滴于切片肿瘤标识区域正面以防止刮取切片时组织飞散。
3．用一次性的解剖刀刮取组织至 1.5mL离心管中，注意需刮肿瘤标识区域的组织。
(注意在刮取组织的过程中，尽量仔细小心)4．重复步骤2直至该样本的所有切片均已被刮下转至同一离心管中.步骤二：DNA脱蜡及消化1．加入1 ml二甲苯至样本管中，盖紧并混匀10秒。
2．室温（15-25℃）下最大离心速度(14000rpm)离2分钟。
3．小心的吸去上清，切勿吸去颗粒(沉淀)，弃上清液。
4．加入1 ml 无水乙醇到沉淀中，震荡混匀（去除二甲苯）。
5．室温（15-25℃）下最大离心速度(14000rpm)离2分钟。
6．吸去上清，切勿吸去沉淀，弃上清液。
7．打开离心管盖子，室温或37℃晾干，约10分钟，直到乙醇完全蒸干。
8．向沉淀中加入180µl Buffer ATL，再加入20µl 蛋白酶K，震荡混匀9．56℃消化过夜，直至样品完全裂解。
石蜡包埋组织中DNA的提取
从 石蜡 包埋组 织 中提 取 ＤＮ 是进 一 步研 究 基 因的 Ａ，
基 础 ， 研 究 抑 癌 基 因 时 需 要 抽 提 肿 瘤 组 织 中 的 ＤＮＡ， 如 而新鲜 的肿瘤 组 织 往往 不能 及 时供 应 ， 其是 研 究肿 瘤 尤 的 转 移 灶 中 的抑 癌 基 因 的 变 化 时 ， 移 灶 肿 瘤 组 织 是 很 转 难 得 到 的 ， 就 需 要 从 能 长 期 保 存 的 石 蜡 包 埋 的 癌 组 织 这 中抽提 Ｄ ＮＡ。 石 蜡 组 织 中 ＤＮＡ 的 抽 提 不 像 新 鲜 组 织 那
一
２ １ ６ 弃 上 清， ． ． 重复 ２ １ ５一 次 。 乙醇漂 洗 的 目的是 除 ．． 去 二 甲苯 。 ２ Ｉ ７ 弃 上 清 ， 入 ２ —０ ｌ 酮 ， ０ 水 浴 放 置 半 小 ．． 加 ０３ ｕ 丙 ５℃ 时至 一小 时 使 丙 酮 完全 挥 发 。这 样 也 可 除 去 残存 的 乙
２ ２ １ 向上述 干 燥 样 品 中加 入 １５ ｌ 白酶 Ｋ 的 消化 ． ． ９ｕ 蛋 缓 冲液 和 ５ ｌ 。
０５ ． ％Ｔ ｅ ２ ｗｅｎ ０酚一 氯仿 饱 和重 蒸酚 加入 等体 积 氯仿 ／ ２：
异 戊 醇 ，混 匀 使 用 。 ＴＥ 缓 冲 液 ：ｌ ｍｍｏ Ｌ ｒ ． Ｏ ｌ Ｔ ｉ ／ ｓ ｃ Ｈ８ ０ １ ｔｏ／ ＤＴ Ｈ８ ０ 配 好 后 １ ｌ ． ：ｒｏ ｌＬ Ｅ Ａ ｐ ． 。 ｐ ｅ ５磅 ／ｍ 湿 ｃ 热灭 菌 １ ５分 钟 。 ３ ｍｍｏ Ｌ Ｎ Ａｃ７： 好 后 １ 磅 ／ ｍ ｌ ａ ＿ 配 ／ Ｊ ５ ｃ 湿热灭菌 １ ５分 钟 ， 装 于 小 管 中 ４ 保 存 。 ７ ％ 乙 醇 ： 分 ℃ ０ 用 ９ ％ 乙 醇 稀 释 配 制 。 １×Ｔ Ｅ 电 泳 缓 冲 液 Ｊ０ ０ Ｍ ５ Ａ ： ．４ Ｔ ｉ 乙 酸 ： ．０ Ｍ ＤＴ ｒ－ Ｓ ０ ０ １ Ｅ Ａ。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 缓 冲 液 ：
石蜡包埋组织DNA提取
石蜡包埋组织DNA提取操作步骤：1.样本处理：制作石蜡切片2.将装有石蜡切片样本的1.5ml离心管中加入1ml二甲苯，震荡均匀后56度温育5min，12000r室温离心2min，用枪头将上清吸出，注意不要去除掉沉淀，重复该步骤3次。
3.向弃沉淀后的离心管内加入1ml无水乙醇，震荡均匀后12000r室温离心5min，用枪头将上清吸出，注意不要去除掉沉淀，重复该步骤2次。
4.室温放置5-10min，充分挥发乙醇，使样品呈现干燥无水状态。
5.加入200μl缓冲液GA和20μl蛋白酶K（可根据样本数量提前将GA和蛋白酶K混合分装，使充分混匀与方便加样），充分混匀后56度温育至样本完全裂解（根据具体实验室情况选择时间，必要和时间允许时可选择过夜温育）。
6.将离心管至于90度孵育1h（原则上不少于30min）。
7.在离心管中加入220μl缓冲液GB和250μl无水乙醇（可根据样本数量提前将GB和无水乙醇混合分装），充分混匀12000r室温离心2min使沉淀沉于管底。
8.准备样本数量相对应的吸附柱（标注样本名称信息等）和收集管，将上述离心管中液体移入吸附柱中（不要吸取沉淀），8000r室温离心2min，将收集管中液体重新移入吸附柱中再8000r室温离心2min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中。
9.向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，8000r室温离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
10.向吸附柱中加入600μl缓冲液PW，8000r室温离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
重复一遍。
11.将收集管12000r室温空离2min，弃收集管，将吸附柱开盖置于预先准备的1.5ml新离心管中悬空放置2-5min，以彻底晒干吸附材料中残余的漂洗液（主要为乙醇，乙醇残留会对酶反应有抑制作用）。
此时可以将TE置于65度预热。
12.向吸附膜中间部位悬空加入40μl洗脱缓冲液TE，静置3-5min，12000r离心2min。
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石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对开矿学延伸。
通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤.切除多余石错，暴露组织.将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24hＴＥ９提取液的制备500mmol/L Tris20mmol/L EDTA10mmol/L NaCl1％SDS500 μg/ml 蛋白酶ＫpH8.04.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次；6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA7.-70℃放置２－４h8.9 000xg离心１h9.沉淀物用70％乙醇洗１次10.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。
不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。
Southern 印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。
故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。
与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。
与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。
PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ）、蛋白酶消化法（Impraimet al.1987；Brice,et al.1989）。
这些方法不经过酚－氯仿－异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min 或在蛋白酶Ｋ缓冲液中消化４h，DNA即可释放出来。
此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且征对性不好。
这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和与引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA 多聚酶的抑制所致。
二、影响DNA提取质量的因素1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。
目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。
Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA 变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。
DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。
Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。
Michel's运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。
Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。
乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。
Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。
每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg，高于新鲜标本（19.4/mm3）。
经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带，说明DNA被完全消化。
Southern 印迹杂交结果与冰冻组织一致。
Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。
其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至－20℃过夜。
然后再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2－3h，石蜡包埋。
结果显示，每10mgAMex法处理的温重组织提得高分子量DNA71.4?4.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4?3.76μg）。
酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。
提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA 降解、高分子量DNA减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。
2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。
这福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。
如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。
然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。
Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。
该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。
固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8％。
Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30％，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应模索选定。
根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110h之内。
3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。
室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。
最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。
通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。
酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。
一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构改变。
当pH达到2.5惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N－糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最多，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。
上述改变亦受温度或离子强度的影响。
加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。
然而，既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。
福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。
4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量晨100bp －10000bp之间，主要分布于100－1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。
这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短下一。
当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的地间长短不一。
虽然本所获得的DNA分子量大。
可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。
组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA弯性，而产生单链DNA片段。
单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。
三、提高DNA提取质量的方法1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。
因此，在DNA提取前应检查组织切片。
如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。
尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。
2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们不同方面进行了探索。
其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消地间的DNA纯化等问题上取得了进展。
①DNA提取液主要为含SDS 和蛋白酶K的TE缓冲液。
固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DNA与蛋白质不易分离。
因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1％-2％，蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。
Koshiba等尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2－巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。
作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2－羟基乙醇。
应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得了高质量DNA。
②DNA释放率对于不同蝗组织类型是有差异的，最决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。