分子生物学诊断技术

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➢用于DNA探针标记的有效 射性同位素和非放射性标 记物
➢常用的放射性同位素有 32P、35S、14C、125I 等
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➢非放射性标记法可将生物 素、地高辛连接在dNTP 上，然后象放射性标记一 样掺入到核酸链中制备标 记探针
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4.DNA杂交
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➢杂交技术有固相杂交和液相
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原位杂交不需从组织中 提取核酸，对于组织中 含量极低的靶序列有极 高的敏感性，在临床应 用上有独特的意义
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杂交的第一步是将DNA 或RNA转移到膜上
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斑点印Байду номын сангаас(dot—blot) 将待测核酸样品变性后
直接点样在膜上，称之为 斑点印迹。为使核酸牢固 结合在膜上，通常还将点 样后的膜进行80℃真空烘 烤2h
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cDNA 探针 是将病原的mRNA反转录
为DNA后获得的。其检测 的对象往往是在生命活动
中可以被激活并进行表达
的基因DNA
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基因组DNA探针 来源于基因组。在寄生
虫上常用基因组重复序列 作为探针。这些重组序列 在基因中高度重复，拷贝 数很多，便于检出。但这 些重复序列并不一定表达
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第二步为杂交反应。
杂交反应包括预杂交、 杂交和漂洗几步操作
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预杂交的目的是用非特 异性DNA分子(鲑精DNA 或小牛胸腺DNA)及其他高 分子化合物(Denhart’s溶液) 将待测核酸分子中的非特 异性位点封闭，以避免这 些位点与探针的非特异性 结合。
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杂交反应是使单链核酸 探针与固定在膜上的待 测核酸单链在一定温度 和条件下进行复性反应 的过程。
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操作时，在暗室内将滤膜 与增感屏、X光片依序放 置暗盒中，再将暗盒置— 70℃曝光适当时间，取出 X光片，进行显影和定影 处理。
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➢用探针对细胞或组织 切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之 为核酸原位杂交。
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其特点是靶分子固定在细胞 中，细胞固定在载玻片上， 以固定的细胞代替纯化的核 酸，然后将载玻片浸入溶有 探针的溶液里，探针进入组 织细胞与靶分子杂交，而靶 分子仍固定在细胞内，以确 定有无该病原体的感染。
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应用斑点印迹技术，可
在一张膜上同时进行多个 样品的检测，操作简便、 快速，在临床诊断中应用 较广，适合进行特定基因 的定性及定量研究，但不 能鉴定所测基因的分子量
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Southern印迹(southern blot) 是指将DNA片段经琼脂糖
凝胶电泳分离后转移到固相 支持物上的过程
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常规处理如下，先用限制
性内切酶对DNA样品进行酶
切处理，经琼脂糖凝胶电泳 将所得DNA片段按分子量大
小分离，接着对凝胶进行变 性处理，使双链DNA解离成 单链，并将其转移到NC膜或
其它固相支持物上，转移后 各DNA片段的相对位置保持 不变。
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Southern印迹的方法有3 种，分别为毛细管转移 (或虹吸印迹)，电转移 和真空印迹，详细操作 可参阅有关书籍
第三节 分子生物学诊断技术
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一、DNA探针(DNA probe) 技术
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1.基本原理
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DNA探针是带有标记物的 已知序列的DNA片段。DNA 探针技术的基本原理是碱基
配对。在变性而成为单链的
被检DNA中加入变性的探针， 随着温度的降低，探针便可
与被检DNA中的互补序列形 成双链，这一过程称杂交。
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通过捕捉探针标记物释放出 的信号，便可知被检DNA中
有无与探针序列相同的DNA 。
每一种病原体都具有独特的 DNA片段，通过分离和标记 这些片段，就可制备出探针， 用于疾病的诊断等研究
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2.DNA探针的种类
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➢按DNA探针的来源可分为 cDNA探针和基因组DNA 探针和动基体DNA(kDNA) 三大类
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杂交反应结束后，应进行 洗膜处理以洗去非特异性
杂交以及未杂交的标记探针 以避免干扰特异性杂
交信号的检测。膜洗净后， 将继续进行杂交信号的检 测
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第三步为杂交信号的检
测。当探针是放射性标记 时，杂交信号的检测通过 放射自显影进行。即利用 放射线在X光片上的成影 作用来检测杂交信号。
杂交之分。固相杂交技术目
前较为常用，先将待测核酸
结合到一定的固相支持物上，
再与液相中的标记探针进行
杂交。固相支持物常用硝酸
纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼 龙膜(nylon membrane)
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➢固相杂交包括膜上印迹杂 交和原位杂交。前者包括 三个基本过程：第一，通 过印迹技术将核酸片段转 移到固相支持物上；第二， 用标记探针与支持物上的 核酸片段进行杂交；第三， 杂交信号的检测
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kDNA探针 是较特殊的一类。在动
基体目原生动物中存在动 基体，内含大量环状DNA， 分大环和小环两种。其中 小环拷贝数占绝对多数。 故往往以克隆的小环或小 环片段做为探针
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近年来，人们往往根据
已知的序列，人工合成寡 聚DNA片段做为DNA探针
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3.DNA探针的标记物及标记
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Southern印迹后的滤膜
仍需进行固定处理，对 NC膜可用80℃真空烘烤 2h，对尼龙膜还可用短 波紫外线(波长254nm)照 射几分钟
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Northern印迹(Northern blot) 是指将RNA片段变性及电
泳分离后，转移到固相支持
物上的过程。RNA的变性方 法与DNA不同，RNA不能用 碱变性，因为碱会导致RNA 水解。
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因此，在Northern印迹前， 须进行RNA变性电泳，在 电泳过程中使RNA解离形 成单链分布在凝胶上，再
进行印迹转移。转移方法 与DNA相似
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RNA变性电泳的原理， 是用一定剂量的乙二醛— 二甲基亚矾，或甲醛和甲 基氢氧化汞等处理RNA样 品和凝胶，使双链RNA在 电泳过程中变性而完全解 离形成单链